酵母双杂交检测实验技术服务

　　随着分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展，为适应对众多基因或蛋白进行功能研究的发展趋势，已出现了很多新技术。其中酵母双杂交技术以其简便，灵敏，高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点在基因功能的研究中得到了广泛的应用。

　　蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验，同以往研究蛋白质-蛋白质之间相互作用的实验手段相比，酵母双杂交系统具有其*优势。

1、融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质保持天然的折叠状态，这是其他离体生化检验方法所缺乏的，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于体内的真实水平。
2、双杂交系统的敏感度非常高，蛋白质之间结合常数低至1mmol/L时都可以被侦测。
3、在筛选cDNA 文库时，双杂交系统能够简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列，它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白，省略了其它体外检测蛋白之间相互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。

酵母双杂交实验原理：

　　以Gal4系统为例，BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA结合结构域与靶蛋白即"诱饵"相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS）结合但不能引起转录，单独的AD则不能与GAL UAS结合；只有当BD与AD分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD与AD才能与GAL UAS结合并且引起报道基因的转录，从而激活下游报告基因，通过这一系列实验来验证两个蛋白之间的相互作用。

★ 酵母单/双杂交检测服务项目列表

服务一、酵母单杂交文库构建服务

　　酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中，识别与DNA特异结合的蛋白质，同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列，而无需分离纯化蛋白，实验简单易行。为了获得良好的酵母单杂交筛选实验结果，构建酵母单杂的文库至关重要，我们可以依据不同的实验需要及物种特性，选择不同的体系建库方法，我们的技术专家可以熟练的应用Clonetech的SAMRT方法和life的gateway方法建立，同时，我们的技术专家也开发出了基于同源重组原理的建库方法。

★ 酵母单杂交文库构建实验流程： 
 1. RNA提取 
 2. mRNA提取 
 3. cDNA的酶促法合成
 4. cDNA连接接头 
 5. cDNA按长度分离 
 6. cDNA与酵母单杂交文库载体pGADT7进行all-direct重组 
 7. 重组产物电转化 
 8. 文库检测以及质粒提取

★ 酵母单杂交文库构建实验材料要求： 

客户构建的酵母单杂交cDNA文库，由客户提供组织、细胞或总RNA给我们即可：

细胞样本：细胞数量大于1*10^7；

动物样本：大于1g；

植物样本：大于2g；

总RNA：大于200ug。

★ 产品质量标准：

 原始文库库容量大于1*10^7CFU；
 平均插入片段大于1000bp ；
 克隆阳性率大于95%。

服务二、酵母单杂交文库筛选技术服务

在研究DNA—蛋白质相互作用中，酵母单杂交体系主要有以下3种用途：

①确定已知DNA—蛋白质之间是否存在相互作用；②分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因；③定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域，以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。

客户仅提供用于筛选的诱饵质粒信息，我们完成杂交筛选相关工作：
 1. 诱饵载体的构建
 2. 诱饵质粒的自激活检测
 3. 文库质粒和诱饵质粒共转酵母感受态细胞
 4. 文库筛选和3AT优化
 5. 文库筛选结果测序分析
 6. 筛选结果回转验证
 7. 详细报告的整理和数据发送

试验完成后提供完整的实验报告，包含实验原始图片，阳性克隆，测序鉴定结果，质粒及菌株等。

服务三、核蛋白体系酵母双杂交文库筛选技术服务

　　艾柏森生物的核蛋白体系酵母双杂交服务可以选择使用life的pDEST22和clonetech的pGADT7两套系统进行筛选，筛选文库可以使用预制商业化文库或者本公司定制构建的酵母杂交文库。 
　 需要指出的是，融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录，因此对于胞外配体-受体作用以及需要核外修饰或受磷酸化等翻译后修饰过程介导的蛋白质间相互作用而言，该系统的应用受到一些限制。在进行文库筛选时，假阳性结果常常干扰实验的准确性，除某些文库编码的蛋白质本身含有转录活化成分外，细胞内的其它无关蛋白也可能有类似作用，因此双杂交系统检测的结果必须通过其它蛋白间相互作用的实验来进一步验证。

客户只需提供用于筛选的诱饵质粒信息，我们完成杂交筛选相关工作：

 1. 诱饵载体的构建
 2. 诱饵质粒的自激活检测
 3. 文库质粒和诱饵质粒共转酵母感受态细胞
 4. 文库筛选和3AT优化
 5. 文库筛选结果测序分析
 6. 筛选结果回转验证
 7. 详细报告的整理和数据发送

服务四、膜蛋白体系酵母双杂交文库筛选技术服务

　　该系统的原理是利用连接有泛素(ubiquitin)的蛋白能够被泛素特异性的蛋白酶(UBPs)识别并切割下泛素，而这种特异性切割只在泛素能够正确折叠的前提下发生。在正常情况下，泛素断裂成两部分后在体内能自发结合成可被 UBPs识别的重构泛素，而当有突变发生时，即泛素的N端发生Ile13/Gly13的突变,这种断裂泛素的重构就无法进行。 只有当与断裂的泛素的两部分分别连接一个蛋白，且两个蛋白之间存在相互作用,断裂泛素的重组又得以恢复。断裂泛素重组的发生能将连接在泛素C端的转录因子切割并进入细胞核内激活报告基因的转录表达，通过报告基因是否表达,可以检测两个蛋白之间是否存在相互作用

　　基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统，区别于传统的核蛋白互作分析，可用于研究膜蛋白间及膜蛋白与胞质蛋白间的互作。在酵母细胞中，泛素可以分成两部分表达，即其N端部分(NubI)和C端部分(Cub)，后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在细胞中组成可分离的泛素蛋白体系

客户只需提供用于筛选的诱饵质粒信息，我们完成杂交筛选相关工作：
1. 诱饵载体的构建
2. 诱饵质粒的自激活检测
3. 文库质粒和诱饵质粒共转酵母感受态细胞
4. 文库筛选和3AT优化
5. 文库筛选结果测序分析
6. 筛选结果回转验证
7. 详细报告的整理和数据发送

客户案例1——

★　酵母杂交文库构建服务案例（限于篇幅，我们只选取了实验报告中部分步骤，如果需要了解更多的实验信息，请联系客服人员）

一、试剂、耗材（略）
二、仪器设备（略）
三、试剂及配制 （略）
四、酵母杂交文库构建实验流程
1、Trizol法RNA的提取
2、使用Oligotex mRNA Kits（Qiagen）分离纯化样本的mRNA，mRNA质量可以满足文库要求，mRNA总量为6.9 ug 
3、酵母双杂交文库构建
3.1、di一链cDNA合成
3.2、cDNA第二链的合成
3.3、加5’接头(3个读码框，每个读码框连接一份，共3份)
3.4、cDNA长度分离, 使用低熔点琼脂糖电泳cDNA，切胶回收1 Kbp以上的条带，乙醇沉淀后溶于14 ul水中。
3.5、使用Infusion重组反应体系连接cDNA与载体pGADT7
3.6、电转化大肠杆菌感受态细胞
4、酵母双杂交文库的构建质量鉴定
4.1、库容量的鉴定
取转化后细菌原液10 uL稀释100倍后，从中取出10 uL涂布LB平板（含氨苄抗性），第二天计数。
CFU/mL=平板上的克隆数/10 uL×100倍×1×103 uL
文库总CFU= CFU/mL×文库菌液总体积（mL）
4.2、插入片段大小鉴定
从转化平板上随机挑取24个单克隆菌落，经PCR扩增后，用电泳检测PCR产物大小。

五、文库扩增及质粒提取
将转化后原始文库菌液涂布氨苄抗性培养基平板扩增培养，第二天用液体培养基从平板上洗脱菌苔，取其中2/3体积用Qiagen大抽试剂盒抽提质粒DNA，剩余1/3体积中加入25%无菌甘油混合均匀后灌装保种管，冻存于-80℃冰箱。
六、文库菌保存和文库筛选
冻存于-80℃冰箱内，可以保存2年以上，文库质粒可以直接用于酵母文库筛选，pGADT7 酵母双杂交文库菌的抗性为氨苄抗性（50 ug/mL）

备注：
 1. 文库构建使用的引物序列，双杂交文库扩增检测引物：
 F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG-3′
 R：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′  
如果需要对文库中的克隆质粒进行测序，请使用以下引物：
 T7：TAATACGACTCACTATAGGGC
 ADR：GTGAACTTGCGGGGTTTTTC

客户案例2——

★ 酵母双杂交文库筛选ORF1的相互作用蛋白服务案例

一、试剂、耗材（略）仪器设备（略）试剂及配制（略）
二、诱饵载体构建pGBKT7- ORF1的构建与鉴定（此步骤为常规的实验方法，可以通过酶切、测序等方法鉴定酵母杂交诱饵载体正确性，此处略）
三、ORF1自激活检测
1、酵母转化反应
将各种质粒转入受体菌AH109中，观察检测结果。

2、酵母转化方法
 1. 从YPDA平板挑取AH109单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18-20 h（过夜），至OD600>1.5，一般为4左右。
 2. 转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5h，至OD600=0.6。
 3. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。
 4. 用20 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
 5. 用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
 6. 用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 ml离心管，每个50 ul（每个转化），备用。
 7. 每个1.5 ml离心管中依次加入相应试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至*混匀。
 8. 30℃水浴孵育，30 min。
 9. 42℃水浴热激，25 min。
 10. 30℃水浴复苏，30 min。
 11. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
 12. 每个转化用200 ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。
 13. 30℃恒温培养4天。
3、ORF1自激活检测结果
pGBKT7-ORF1 + pGADT7共转化AH109长出的酵母转化子随机挑取了6个菌落进行自激活检测。包括HIS3、ADE2和LacZ共3个报告基因的检测。
HIS3和ADE2的检测采用点板培养的方法，将转化子点板至SD-TLHA平板，30℃恒温培养4天，观察其生长状态。
LacZ报告基因的检测方法如下：
 1. 从转化平板随机挑取6个菌落于滤纸片上。
 2. 将滤纸*浸于液氮中90 s，取出常温放置2 min晾干。
 3. 在培养皿中加入新鲜配制的显色液，一般9 cm培养皿用2-3 ml显色液。
4、将显色液加入培养皿中，再放入一张干净的滤纸，让其*浸湿，将冻溶后的滤纸放在上面，使显色液浸透表层，盖上皿盖。30℃避光培养，20 min后开始观察，一般2 h后可开始看到颜色变化。4-5h拍照记录结果。

对照菌株在SD-TL缺陷平板上都能正常生长，而仅有阳性对照可在SD-TLHA缺陷平板生长。pGBKT7-ORF1  +pGADT7转化子中随机挑选的6个菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生长，生长状态同阴性对照，LacZ检测中结果也与阴性对照相同，因此不存在自激活。

自激活检测结论：ORF1诱饵克隆没有自激活作用。

四、文库筛选 
用含有正确pGBKT7-ORF1诱饵质粒的AH109酵母转化子作为受体菌制备感受态，将文库质粒pGADT7-酵母双杂-cDNA转入其中，涂SD-Trp-Leu-His+  5 mM 3AT平板。

五、影印清除
为了消除背景生长菌落的干扰，在培养到第3天时，用绒布对筛库平板进行影印清除后，继续培养7-14天。分批挑取再次长出的转化子菌落进行下一步检测。

六、阳性克隆鉴定
至影印清除后继续培养7-14天，从筛库平板中挑取长出的阳性克隆单菌落，共挑取到20个初始阳性克隆转化子转接到SD-TL缺陷型平板中继续培养2-3天。
1.　阳性克隆His和Ade报告基因的检测 
将上述SD-TL缺陷型平板上长出的20个初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点种至SD-TL和SD-TLHA缺陷平板，30℃恒温培养3-4天。

阳性克隆检测结果显示：在20个初始阳性克隆中，有13个能在SD-TLHA生长的是激活了ADE2和HIS3报告基因。

2.　阳性克隆LacZ报告基因检测
将20个初始阳性克隆用无菌水重悬后点于滤纸片上进行LacZ报告基因检测。结果如下图所示：

七、酵母阳性克隆DNA提取和测序比对

通过测序比对，可以将重复的阳性给克隆子去除，本实验案例中，有多个克隆子为重复的阳性克隆，经过筛除后，我们可以确认获得了6个*不同的阳性克隆子。

八、回转验证
用含有正确pGBKT7-ORF1诱饵质粒的AH109酵母转化子作为受体菌制备感受态，将6种阳性克隆质粒DNA分别转化其中，分别回转验证His和Ade报告基因的检测和LacZ报告基因检测。

实验结论：

本项目以ORF1基因cDNA克隆为诱饵，筛选cDNA酵母双杂交文库，在筛选到的20个初始阳性中，经过鉴定结果显示有13个能激活ADE2、HIS3和LacZ报告基因。经过对这些阳性克隆质粒进行DNA测序和BLAST比对分析，结果表明它们分别属于6种不同蛋白的编码基因。

通过对这6种阳性克隆的回转验证检测，结果显示所有阳性克隆都能通过对ADE2、HIS3和LacZ报告基因的回转验证。