抗体人源化简介

抗体人源化改造是增加异源抗体中人源序列比率的过程。随着杂交瘤技术的发展，大批的与抗原有特异亲和力的异源（通常是鼠源）抗体引起了人们的兴趣，但是由于HAMA效应的存在，大大限制了这些抗体在临床上的应用。而且这些异源抗体往往半衰期短，且能引起机体的炎症效应。抗体人源化的过程就是解决异源单克隆抗体免疫原性，改善抗体对人体免疫系统的活化作用。

艾柏森生物拥有丰富的抗体人源化经验，我们利用多种策略进行抗体的人源化改造，可以在保留抗体特异性的同时，大部分或者全部消除异源抗体在人体内的免疫原性。其中包括重构抗体、链替换抗体及表面重塑抗体等，通过建立噬菌体展示的人源化突变库，筛选出高亲和力的人源化抗体，也可以通过哺乳动物细胞表面展示技术建立人源化的IgG库，通过FACS分类筛选。

艾柏森生物人源化服务基本流程：

抗体测序——同源建模——CDR移植——设计改造

服务流程：

技术流程：

艾柏森生物提供多样化的策略，包括：

抗体人源化策略：CDR&SDR移植、链替换及人源IgG抗体库筛选；

抗体亲和力成熟策略包括：随机突变、定点突变等多种突变方式；

结合专有人类抗体数据库、电子建模等技术。

CDR移植抗体构建流程：

1.质控

对客户提供的亲本抗体做活性验证，确认是否有必要进行人源化改造。

2.抗体基因获得

提取杂交瘤细胞中mRNA，反转录为cDNA，PCR扩增VH和VL链，测序。

3.生物信息学方法设计人源化方案

3.1分析亲本抗体VH和VL序列，进行亚型分类、计算机模拟抗体结构分析及多序列比对进行CDR区和FR区定位，确定FR区保守氨基酸及关键氨基酸残基及其位置。

a. V区、CDR及FR序列的确定

利用序列相似性搜索方法确定恒定区（CH和Cκ），然后找到序列引物，之间即为V区。将V区基因序列翻译为氨基酸序列，通过Kabat数据库和Swiss-Port数据库比较，确定CDR和二硫键位置。

表： h-TNFα鼠单抗CDR和FR确定；*代表二硫键的Cys位置

b.抗体V区结构同源建模及抗原抗体复合物模型构建

（1）模板蛋白的选择

利用PDB数据库，搜索抗体V区同源蛋白，从而确定模板蛋白结构和序列，如下图。

（2）SCR和Loop区的确定

利用Structure Superimpose法对模板蛋白进行结构相似性分析，确定模板蛋白的结构保守区（SCR）和无规则环区（Loop）。通过多序列比对，确定目的蛋白的SCR和Loop。

（3）抗体VH和VL初始结构的获得

（4）初始结构构象优化及分子动力学模拟

首先用Insight Ⅱ(2000)中Rotamer软件对模型构象的二面角调整，再用Discovery软件，在CVFF、Gromos力场下，经陡下降、共轭梯度、牛顿力学等步骤对抗体V区构象进行优化。再通过动力学优化，获得稳定的空间构象。见图1。

图：经过分子模拟、力学优化、动力学模拟获得抗体VH和VL碳原子空间构象

（5）抗体V区空间构象合理性判断

利用Ramachandran图对获得的抗体可变区构象进行评价，如下图所示，不同颜色代表了氨基酸残基构象的合理程度。红色代表残基构象匹配适宜，深黄色表示残基构象允许区，土黄色表示构象可以，白色表示构象存在较大误差。

图 利用Ramachandran图对抗体的V区残基进行构象评估

（5）抗体可变区Fv构象的获得

选择同一个包含VH和VL的构象的模板为参考，考虑VH和VL相互作用模式，分析可及性表面是和表观静电分布情况，利用Molecular Docking的方法获得抗体V区构象。

图3 抗体可变区的空间构象

（6）抗原-抗体复合物模型的建立

抗原-抗体相互作用复合物结构是合理判定抗原表位、抗体合理改造与设计的基础。利用Molecular Docking方法，探讨抗原-抗体相互作用，确认二者相互识别过程中静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华力作用等，预测二者的结合模式和亲和能力，从而进行抗原表位合理预测、抗体人源化和亲和力改造。

图   利用分子对接方法建立抗原-抗体复合物结构模型

（7）抗体FR区中重要氨基酸残基的确定

利用SAS方程，计算可及性表面积；利用Delphi程序，计算表观静电分布。基于以下原则确定抗体FR区中重要氨基酸残基：

3.2通过Kabat、Genebank和IMGT等数据库检索比对和辅助计算机分子模拟，寻找大同源性的人FR区模板，设计CDR移植scFV，进行计算机结构模拟分析。

a. 人源抗体模板的选择及FR区保守氨基酸的确定

在NCBI网站，运行IgBLAST，通过BlastP程序，检索人源库中鼠抗体V区同源序列，通过序列比对归纳出人抗体FR中高频率出现的氨基酸残基及位置。

b. 鼠源抗体人源化过程中需要改变的残基确定

根据可及表面积、表观静电分布及序列比对的结果，确定人源化过程中需要改变的氨基酸残基。

c. 点突变的Fv空间结构模拟

利用计算机建模、力学优化及动力学模拟得到人源化抗体的V区构象，通过结构叠合进行亲本抗体和人源化抗体的构象比较。

d. 人源化后抗体活性预测

借助Molecular Docking和动力学模拟优化人源化后抗体-抗原复合物的结构，通过相互作用能、分子间氢键以及识别表位，从理论上评价异源抗体人源化后的生物学活性。

3.3表达重构抗体和亲本scFV抗体

根据计算机模拟设计的人源化方案，合成基因，表达48-126个重构抗体，分别测定其与抗原的相对结合活性。测定亲本scFV抗体亲和力，挑选亲和力的人源化抗体克隆，进行亲和力成熟改造。