使用步骤

1、取 5-15 mL 过夜培养菌液加入离心管中，12000 pm 离心 1 min 收集菌体沉淀，尽量吸弃上清。

2、向留有菌体沉淀的离心管中加入 500 uL Buffer P1 (已加入RNase A)，使用移液枪或旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀，混匀至无菌块。

3、向离心管中加入 500 uL Bufcr P2，温和上下颠倒混匀 4-6 次，充分混匀使菌体裂解，此时溶液应变得清亮粘稠。

注意:温和地混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组 DNA。所用时间不应超过 5 min，以免质粒受到破坏

4、向离心管中加入 700 uL Bufer P3，立即温和上下颠倒混匀 8-10 次，充分混匀，此时应

出现白色絮状沉淀，12000 rpm 离心 10 min。注意: P3 加入后立即混合，避免产生局部沉淀。如果离心完仍有沉淀漂浮，可延长离心时间取上清。

5、将步骤 4 中的上清液分批转移到已装入收集管的吸附柱中，12000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。注意:一根吸附柱最大容积为 750 uL，请分两次转移上清液到吸附柱中。

6、向吸附柱中加入 500 uL Bufer PD，12000 rpm 离心 1 min，弃废液。

7、向吸附柱中加入 600 uL Buffer PW (使用前请确认是否加入无水乙醇)，12000rpm 离心1 min，弃废液。

注意:加入漂洗液 PW 后，室温静置 2-5 min，有助于更好的去除杂质。

8、重复一次步骤 7。

9、将吸附柱重新放回收集管中，12,000 rpm 离心 2 min，目的是去除吸附柱中残余的漂洗液。注意:乙醇残留会抑制后续的酶反应，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数分钟，确保乙醇挥发干净。

10、将吸附柱放到一个干净灭菌 1.5 L 离心管中，将吸附柱开盖静置数分钟。向吸附膜中间位置悬空滴加 50-100 uL Buffer TE 或 ddHO (可提前放在 5565 C水浴锅中预热，提高质粒 DNA 回收率)，室温放置 2 min。12,000 rpm ，离心 2 min 收集质粒 DNA 溶液(若需要获得最高产量，建议将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复第 10 步进行二次洗脱。)。

11、质粒溶液保存在- 20C。