质粒DNA提取、纯化和鉴定
时间：2020-12-03 阅读：2012
一、实验原理
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不*分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯fang抽提除去，后获得纯度较高的质粒DNA。
简言之：在细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA 释放到溶液中，当PH为12时，DNA的氢键断开，由于质粒DNA为环状结构，所以两条链没有分离，而染色体DNA两条链*分开，氢键断开而分离。当PH值恢复到中性时，质粒DNA恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中-------------除去染色体DNA、大分子RNA和蛋白质-SDS复合物缠连成白色絮状沉淀，离心分离。
加入乙醇后，上清质粒DNA凝聚成沉淀，会有RNA存在，加入RNA酶，使RNA降解。---------------去除RNA分子。
二、实验仪器
微量取液器（20、200、1000微升）、台式高速离心机、恒温震荡摇床、高速蒸汽消毒器（灭菌锅）、涡旋震荡器、电泳仪、琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。
三、实验步骤
碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
①细菌的培养和收集
将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。 (培养箱、摇床)
②质粒DNA少量快速提取
1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。（移液器、离心机）
2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。（移液器）
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。（移液器）
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。 （移液器、离心机）
6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯fang(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。
7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。 （冰箱、离心机）
8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。
9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
* 溶液一：重悬菌体，提供缓冲环境。
溶液二：氢氧化钠和SDS裂解菌体细胞壁、在细胞膜上穿孔，释放细胞内的质粒。
溶液三：中和氢氧化钠、SDS中的钠被钾替换，吸附菌体产生沉淀。
③DNA鉴定
实验仪器
恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，旋涡振荡器，水浴锅，1.5mL离心管，50mL离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf管等。
DNA纯度检测
（1） 取40mLTAE（1×）于300mL锥形瓶中，加入0.4g琼脂糖，放入微 波炉内使其熔化，60℃时倒入准备好的制胶槽中。（微波炉、制胶槽、梳子）
（2） 取5.0μl纯化DNA加入1.0μl上样缓冲液，混合，进行点样。（移液器、电泳仪）
（3） 点样完毕后，100V，200mA条件下电泳30min。
（4） 电泳完毕后，进行EB染色，用凝胶成像仪拍照，得到实验结果。（凝胶成像系统）