一、  实验目的

1)  了解并掌握光学显微镜的操作方法和观察技巧

2)  学会细菌及真菌观察鉴定的一系列实验方法及其原理

二、实验器材

1.试剂及药品：

结晶紫染液、 95%乙醇、番红染液、 5%孔雀绿水溶液、甘油、 1 mol/L NaOH 溶液  、 1 mol/L 

HCl 溶液、卢戈式碘液、溴甲酚紫指示剂、甲基红指示剂、吲哚试剂、NaCl、1.6%花生油中

性红水溶液、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液、灭菌水等。

2.器材： 

三角瓶、试管、烧杯、培养皿、接种环、接种针、载玻片、盖玻片、酒精灯、涂布棒、显微镜、电子天平、药匙、玻璃棒、称量纸、量筒、加热炉、PH 试纸、高压蒸汽灭菌锅、棉花、纱布、牛皮纸、麻绳、恒温箱、试管架、剪刀、镊子、解剖刀、U 形管、移液管等。

3.样品：

校园内草地深层土壤（深度 20cm）

三、实验原理

1.细菌简单染色

利用单一染料对菌体进行染色的方法叫做简单染色。

2.细菌的革兰氏染色

经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。

3.细菌芽孢染色

首先用着色能力较强的染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。再用对比度大的复染剂（如番红液）染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样就可以将两者区别开来。

4.细菌的生理生化实验

糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应

甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。

5.真菌的观察及鉴定

将培养物直接置于显微镜下可观察到霉菌自然生长状态并可连续观察不同时期发育期的菌体结构特征的变化。

四、实验步骤

4.1 土壤菌群分离

4.1.1 灭菌准备

配制牛肉膏蛋白胨培养基和 PDA 培养基，分别装入三角瓶中，封好。将内装 90ml 的蒸馏水和玻璃珠若干的三角瓶、已配好的培养基、涂布棒、移液管六支、试管（内装 9ml 蒸馏水）六支、平皿若干放入灭菌锅中灭菌。

4.1.2 梯度稀释

称取土壤样品 10g 加入 90ml 灭菌水中振荡，直至土壤大颗粒被*打碎，然后静置 30 分钟以上，使其澄清。实验时要保持无菌操作，防止杂菌污染土壤菌液。梯度稀释是将原液按照十倍的等级进行稀释，在无菌的条件下，用移液管一取 1ml 上清液加入装有 9ml 灭菌水试管中振荡，将其稀释为 10-1倍，用不同的移液管依次从已稀释的菌液中取液，将菌液梯度稀释为原液的 10-1、10-2、10-3、10-410-5

倍，分别为-1、-2、-3、-4、-5 梯度，分别表示稀释原液用 0表示。

4.1.3 涂布平板

将冷却至 50-55℃的牛肉膏蛋白胨培养基和 PDA 培养基倒平板，平板固定后进行涂布。在无菌条件下，用对应编号的移液管取菌液加到平板中，然后用涂布棒将其在平板铺匀。细菌培养基对 0、 -2、 -4、 -5 梯度进行涂布，霉菌培养基对 0、 -3 梯度进行涂布。每梯度涂 3 个平板。

4.1.4 恒温培养

将霉菌培养基放入 27℃恒温箱中培养 3 天，将细菌培养基平板置于 37℃恒温培养 24 小时。

4.1.5 菌落统计

对不同梯度的平板进行观察，选择合适梯度进行菌落计数，一般每平板 30 个为宜。此次试验中，细菌培养基上-4 梯度为*佳。霉菌培养基中-3 梯度为*佳。在细菌培养基中，根据菌落形态的不同选取 5 种菌，考虑到可能有的菌相同，本组选取了6 种菌，对其进行观察，描述菌落形态。选择三种霉菌，对其编号。

4.1.6 画线分离

配制牛肉膏蛋白胨培养基和 PDA 培养基，灭菌（灭菌锅：山东兴华）后倒取平板，将选出的菌进行划线分离，考虑到菌数多，平板不足，每种菌只划两个平板。划好后分别放入相应恒温箱中培养。

4.2 细菌的纯化及鉴定

4.2.1 细菌纯化及保藏

配制培养基，在不同菌划线的培养基中挑取单个菌落进行再次划线，直至菌种*纯化。

制备试管斜面，将菌划斜面培养留种。 

4.2.2 细菌形态观察

对各菌进行制片，进行单染色观察其形态

4.2.3 革兰氏染色

为鉴定细菌的革兰氏反应对菌进行革兰氏染色，染色前先将进行标准株培养，标准株为大肠杆菌（革兰氏阴性菌）、金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌），将标准株与纯化的八株菌进行培养 12-18 小时，这样无芽孢的产生，可以防止其影响染色结果。染色完成后进行镜检。

4.2.4 穿刺实验

穿刺实验是对菌是否有鞭毛进行鉴定的十分有效的方法。

配制细菌穿刺培养基，该培养基与细菌培养基大体相同，将其中的琼脂减少的原来的一半

即为半固体穿刺培养基。

（1）将培养基配好后加热(微波炉)，使其*融化，略微冷却后倒入试管中，密封后灭菌。

（2）冷却固定后，在无菌（超净工作台：内循环风，苏净安泰）操作下，用接种针将各菌穿刺接种到半固体培养基中，穿刺时

尽量要直，避免划坏培养基。

（3）将接种好的穿刺培养基放入 37℃的恒温箱中培养 24 小时。

4.2.5 细菌芽孢染色

1)  制片

按常规涂片、干燥、固定。

2)  染色

加数滴 5%孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火（普通酒精灯）上加热至染料冒蒸汽并开始计时。维持 5min。加热过程中及时补充染液。切勿让涂片干涸。

3)  水洗

待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。 

4)  复染

用 0.5%番红染液复染 1.5min 。 

5)  水洗

用缓流水洗后，干燥。

6)  镜检（普通光学显微镜）

先低倍镜，再高倍镜，后油镜观察。

4.2.6 生理生化试验

（1）配制培养基

分别配制淀粉培养基、油脂培养基，配制好后放入三角瓶中准备灭菌。配制葡萄糖和乳糖发酵培养基，装入试管，将其中的德汉氏小管灌满放入试管。配制蛋白胨水培养基和葡萄糖蛋白胨水培养基，配制好后加入试管中，每支试管 1/3 体积培养基，准备灭菌。

（2）接种准备

将培养基贴上标签包好后放到高压蒸汽灭菌锅中，在 121℃灭菌 20 分钟。灭完菌取出后冷却，将淀粉培养基、油脂培养基倒平板。 

（3）接种

①在淀粉培养基、油脂培养基平板背面用标签笔画一个十字，将其分为相等的四个区域，再在相应的位置写上要种的菌种的编号，在无菌条件下，将菌种分别接在相应的区域，对于淀粉培养基，在接种时，采取触点接种，对于脂肪培养基，采取画十字接种,贴上标签。

②在无菌条件下，将各菌种分别接在糖发酵培养基液中，每种菌在葡萄糖和乳糖培养基中各接两支培养基，每种留一支作为对照，贴上标签。

③在无菌条件下，将各菌分别接种在蛋白胨水培养基和葡萄糖蛋白胨水培养基中，每种菌分别在蛋白胨水培养基和葡萄糖蛋白胨水培养基中接两支培养基试管，贴上标签。

（4）培养

将接种好的培养基放到 37 摄氏度的恒温箱中培养 48 小时。

（5）实验观察

4.2.7 确定菌属

在根据以上实验结果的基础上，查询伯杰氏手册，确定菌的属。

4.3 霉菌的纯化及鉴定

4.3.1 霉菌纯化

配制 PDA 培养基，将霉菌再次划线，直至菌种*纯化。

4.3.2 霉菌形态观察

（1）营养小室及其他灭菌准备

（2）制备营养小室

（3）接种

（4）放置 27℃恒温箱中培养三天

（5）培养三天后，将营养小室从恒温箱中取出，用显微镜观察霉菌形态。

4.3.4 霉菌鉴定

根据观察结果，查询相应的霉菌图谱，确定分离出的霉菌的类别。