通过结构调控花青 J 聚集体实现多路复用光声和荧光的生物成像
时间：2024-09-27 阅读：158
本文要点：J-聚集为分子染料带来了有趣的光学和电子特性，显著扩展了它们在不同领域的适用性，但合理设计 J-聚集染料仍然存在挑战。在此，本文通过逐步细化一种常见的七甲胺花青的结构，从零开始开发了大量的 J 聚集染料。通过在染料的介观位置引入具有苄基和三氟乙酰基的支链结构获得了具有尖锐光谱带（半峰全宽≤38 nm）的 J 聚集体。微调苄基可以实现 J 聚集体的光谱调节。对9种染料的单晶数据的分析揭示了 J 聚集倾向与晶体内分子排列之间的相关性。一些 J 聚集体已成功应用于动物的多路复用光声和荧光成像。值得注意的是，由于 J 聚集体具有清晰而明显的吸收带，实现了高时空分辨率的三色多光谱光声断层扫描成像。
本文逐步调整了一种常见的七甲胺花青的结构，通过在七亚jia基苯并吲哚菁骨架上引入具有三氟乙酰基和苄基的支链介旋取代基，成功地获得了十几种具有异常窄光谱带（半峰全宽≤38 nm）的J-聚集体。此外，通过微调 J 聚集染料上的苄基部分来实现对光学性质的控制。首先，本文成功地从这些染料中培养出9个单晶，并分析了它们的晶体学数据，从而为J聚集体中的堆积排列提供了见解。这项研究能够评估染料的J聚集倾向与相应单晶中的分子排列之间的相关性。其次，研究者精心挑选了几个样品用于NIR-II双模和多路（三色）多光谱光声断层扫描（MSOT）和荧光成像。本文成功通过高时空分辨率实现了多个器官内不同染料的同时成像。
本文对 J-聚集的研究始于化合物 1，它是一种七甲胺吲哚菁，在聚亚甲基桥中的环己烯上具有内消旋氯。1的结构修饰涉及几个关键步骤，即在中心位置用环戊烯取代环己烯部分，在两个末端用苯吲哚取代吲哚，将吲哚氮取代基从乙基改变为甲基和丙基，以及逐步改变介消旋取代基。研究者寻求在NIR-II区域获得具有吸收带的良好形成的J聚集体，导致了CYJ1007的出现（由9形成）。这一突破是通过引入由苄基和三氟乙酰基组成的支链内消旋取代基来实现的。进一步微调苄基部分可以调节 J 聚集体的光学特性。最终，研究者得到了 16 种 J 聚集染料，其中 10 种（9、17、19-25 和 28）可以形成形态良好的聚集体，其光谱几乎没有单体迹象，1 （5） 种可以形成 H 聚集体，2种（4 和 6 ）似乎同时表现出 H 和 J 聚集体的光谱特性。
通过将特定 J 聚集染料的 DMSO 溶液然后通过离心纯化来制备大量 J 聚集体。将所得的 J 聚集体重新分散在 HEPES 缓冲液中，用于光学研究。染料和J-聚集体的光学特性如图2a所示。以化合物 9 为例，比较了单体和 J-聚集体的光学性质（图 2a–2c）。如图 2a 所示，化合物 9（单体）具有相对较宽的吸收带，最长为 878 nm，而其 J 聚集体 （CYJ1007） 在1007 nm 处表现出尖锐、红移和强烈的吸收带，以及几乎重叠的荧光带。此外，CYJ1007显示出强烈的丁达尔效应，这是粒子形成的标志。如在TEM上观察到的那样，颗粒呈现出球形形态。如图 2b 所示，J 聚集体的荧光寿命比单体短得多，为 J 聚集体的形成提供了额外的证据。此外，圆二色性（CD）光谱（图2c）显示，单体在600 nm至1200 nm范围内不表现出CD信号，而J聚集体CJY1007在CYJ1007的吸收（1007 nm）处显示出具有强烈、尖锐和负峰的CD信号，这可能是由J聚集体中的手性排列、激子耦合和/或长程有序引起的。
聚集体的形成相当快，如将化合物9的DMSO溶液加入HEPES后10分钟内吸光度突然增加所证明的那样（图2d）。化合物9在30nM至50nM之间的HEPES溶液中也表现出低临界聚集浓度，同时在生物体液中具有很强的J聚集倾向。有趣的是，一些单体的吸收光谱几乎相互重叠（图2e），而其J聚集体的吸收光谱各不相同，范围从1007 nm到1059 nm（图2f）。J聚集体在生理pH值下还表现出相当的pH稳定性，比单体具有更好的光稳定性，并且在37°C下在FBS中具有相当的稳定性。为了追求这些 J 聚集体在水性介质中的更大稳定性，这对于体内光学成像至关重要，研究者将 J 聚集体封装在 Pluronic F127 胶束中。值得注意的是，这种封装仅引起其吸收光谱的微小变化，同时大大提高了它们的稳定性。HEPES中封装的J聚集体比商业和报道的NIR-II分子染料和水性介质中的J-聚集体具有更窄的光谱带。
从化合物 10 和 14 开始分析，这两种化合物都不能形成 J 聚集体。化合物10采用“人字形”堆叠（图3a），相邻堆叠在相反方向上“俯仰”和“滚动”，其相邻分子在堆栈内表现出较大的横向位移（3.57 Å）（图3a4），因此它们之间的π-π相互作用可以忽略不计。对于化合物14，其末端基团高度扭曲和弯曲，两个苯并吲哚平面之间具有较大的二面角（图3b）。在14中，苯环直接连接到三氟乙胺基团导致较大的空间位阻，使14成为“拥挤”的菁并抵消J聚集。显然，10 和 14 的单晶中的堆积排列不利于 J 聚集。
化合物8、15、11、9、24和19在单晶中都表现出砖层堆积，其分子堆积排列的特点是纵向位移大，横向位移小，有利于J聚集体的形成（图3c-3e）。然而，观察到化合物 8 和 15 尽管它们在分子结构上与 9 高度相似（8 在介观取代基处的乙酰基与三氟乙酰基，以及 15 在吲哚氮处的甲基与乙基），但未能形成 J 聚集体，而其他四种 （9、11、24 和 19） 可以。单晶是通过非常缓慢的溶剂扩散过程生长的，该过程更像是热力学上有利的过程。六种染料在单晶内的分子排列表明它们可能具有形成J 聚集体的倾向。然而，与单晶相比，水介质中J聚集体的形成更复杂、更迅速，动力学因素成为J聚集体形成的关键决定因素。8 中介消旋取代基上的乙酰基和 15 中吲哚氮上的甲基与 9 中的对应物相比尺寸相对较小。这可能导致 8 和 15 的分子振荡增加，尤其是当放置在水性介质中时，从而降低它们的 J 聚集能力。关于9、24和19形成的三种单晶，它们都可以形成J聚集体，并且其结构中具有苯吲哚末端基团，观察到它们的层间纵向位移（18.70、19.57和19.95 Å）与相应的J聚集体表现出的吸收量（1007、1045和1059）之间存在正相关关系。
这些结果表明，单晶内的堆积排列与J聚集之间存在有意义的相关性，这意味着理解单晶内的分子堆积可能是评估染料J聚集倾向的宝贵方法。控制单晶内分子堆积的各种力和空间位阻因素也可以在J聚集染料的设计中得到利用。
在 NIR-II 光声成像中，在 1050 nm 至 1150 nm 的波长范围内工作可以显着减少来自各种内源性吸收剂的干扰，包括水、血红蛋白、氧合血红蛋白和脂质。因此，本文选择了样品CYJ1059@F127进行单色成像。
对 J 聚集染料构建了一系列染料和 J 聚集体，使研究者能够进行多路荧光和 MSOT 成像（图 4 和 5）。为了实现光谱分离并限度地减少三色成像中的串扰，本文选择了两种 J 聚集体（CYJ981@F127 和CYJ1059@F127）和一个单体（化合物 1，用转运蛋白 β-LG 处理形成 1@β-LG 用于肾脏靶向).图4a-i和5a显示了三种样品在pH 7.4 HEPES溶液中的吸收和光声光谱。
小鼠俯卧（图4b-4d）和仰卧（图4e-4g）位置进行三色荧光成像。对于前者，将CYJ981@F127注射到小鼠后肢的爪子中，而静脉注射1@β-LG在12分钟和CYJ1059@F127注射15分钟进行（图4b）。图4c、4d和S60显示了不同激发波长下的荧光图像和不同时间点的合并荧光图像。正如预期的那样，CYJ981@F127表现出通过爪子的淋巴管迁移到淋巴结。相比之下，发现 1@β-LG 仅在肾脏中积累，而 CYJ1059@F127 表现出在整个血液中的全身分布。值得注意的是，通过三色荧光成像可以清楚地辨别出所有三种不同的过程。这归因于 J 聚集，它使染料单体的光谱带锐化。
对于仰卧位的小鼠，通过管胃管将CYJ981@F127施用于小鼠胃的底部，而另外两个通过静脉注射引入（图4e）。在不同波长下进行成像，以观察膀胱（肾脏代谢后）、肠道CYJ981@F127和肝脏中 CYJ1059@F127 的 1@β-LG。同样，在不同器官内的三种染料也被清楚地观察到，如图4f、4g所示。
图5. 1@β-LG （50 μM）、CYJ981@F127 （50 μM） 或 CYJ1059@F127 （50 μM） 注射三组染料三色MSOT成像
三色多光谱光声断层扫描 （MSOT） 成像是通过将三种染料注入小鼠体内并在单次运行中用多个 （13） 个波长照亮每个样品（图 5a）进行的，然后进行超声检测、重建和光谱分离。为了评估在多路 MSOT 成像框架内三种染料之间的潜在串扰，进行了一项评估，涉及皮下注射三种单独的染料或三个染料组（标记为 I、II 和 III 组，每组包含两种不同的染料，如图 5b 所示）到小鼠中。这些注射剂在小鼠的三个不同部位小心地进行，分别位于背部、左腰部和右腰部。评估结果（图5c和S62）表明，在这两种实验场景中都不存在串扰。作为一个说明性的例子，当将1@B-LG施用于小鼠的左腰（I组）和右腰（III组）时，从1@B-LG（左上图）发出的MSOT信号精确地定位在左腰部和右腰部，确认成像中没有串扰（图5c）。
随后，进行三色MSOT成像，以阐明三种染料给药后的生物分布，成像过程的时间线如图5d所示。将个体小鼠轻轻麻醉并小心地放置在成像室中进行MSOT成像，其持续时间为-6分钟至62分钟。在0 min和10 min时，分别通过尾静脉将CYJ981@F127和1@β-LG注射到小鼠胃中，而在20 min时通过管饲管将CYJ1059@F127递送至小鼠胃底部。通过扫描小鼠腹部区域的特定部分获得一堆横截面（2D）MSOT图像，这些横截面图像可以单独检查或渲染成3D表示（强度投影，MIP）。图5e显示了小鼠的冷冻切片图像，其横截面位置与图5f中的横截面位置相对应。通过记录每种染料的信号，可以监测三种染料的生物分布，如单通道和复合图像所示（图5f）。显而易见的是，1@β-LG选择性地在两个肾脏内积累，而CYJ981@F127和CYJ1059@F127分别位于肝脏和肠道中。两个感兴趣区域的三色MSOT成像进一步证实了这一观察结果。此外，图5g中的3D MSOT图像提供了与三种染料分布相关的空间信息，使研究者能够更精确地定位染料的生物分布。离体三色成像为三色MSOT成像提供了额外的证据。重要的是，染料的低细胞毒性和体内毒性分别通过细胞毒性研究和主要解剖器官切片的苏木精和伊红（H&E）染色得到验证。
这项研究揭示了一种有前景的解决方案，通过在七亚甲基菁的介观位置引入包含三氟乙酰基单元和苄基单元的庞大支链结构，确保J聚集体在NIR-II区域的吸收带。通过对N-苄基部分的微小修饰，已经获得了一系列具有不同光谱性质的J聚集体。已经成功生长了九种单晶，对这些晶体学数据进行了比较分析，这表明，当染料的单晶结构表现出与J聚集一致的特征时，它可能具有形成J聚集体的内在趋势。此外，一系列 J 聚集体的可用性，其特点是具有有利的光谱特性，包括红移和窄吸收/发射光谱以及增强的消光系数，能够构建用于多路复用三色 NIR-II 荧光和 MSOT 成像的染料组合，在无串扰的成像中实现显着的时空精度。这项研究为生成具有所需光谱特性的J聚集体提供了一种有效且直接的方法。
参考文献
Zhang C, Wu Y, Zeng F, et al. Structurally Modulated Formation of Cyanine J‐Aggregates with Sharp and Tunable Spectra for Multiplexed Optoacoustic and Fluorescence Bioimaging[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2024, 63(34): e202406694.
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