本文要点：使用短波红外（SWIR）（1000-2000 nm）分子染料进行体内生物成像相比于可见光和近红外-I（NIR-I，700-900 nm）染料，能够实现更深的穿透和更高的对比度。开发新的SWIR分子仍然相当具有挑战性。本研究开发了SRHCYs，一组基于半花菁的荧光染料，其吸收（830-1144 nm）和发射（886-1217 nm）波长可调。通过增强供体部分和延长多亚甲基链，这些染料的光物理属性得到了精确调整。SRHCY-3，具有可点击的叠氮基团，被选用于活体小鼠血管的高性能成像，实现了脑和肺癌的精确检测。这些探针的组合实现了体内多色成像，几乎没有光学串扰。该报告展示了一系列具有良好光谱特性的SWIR半花菁染料，用于高对比度生物成像和多重检测。

活体成像

在这项研究中，通过分子工程设计、合成和评估了一系列名为SRHCYs的新型半菁染料，在 SWIR 窗口中具有可调的吸光度 （830-1144 nm） 和发射 （886-1217 nm） 光谱。应用供体增强和聚甲辛链延伸两种策略来实现分子光学性质的高效调控，并建立了结构-光物理关系。此外，在对小鼠血液/肿瘤血管和淋巴管系统进行 SWIR 成像后，优化的体内循环速率能够在活体小鼠中进行癌症成像。SRHCY还具有集成可调谐 SWIR 吸收和发射特性的优势，因此可以选择适用的荧光团来匹配可用于体内SWIR多色成像的可用激光器和滤光片组。

在NIR-I 研究领域中，通过在碱存在下加热氯取代花青染料（如 IR-783）的溶液来生成半菁染料。将花青染料 FD-1080 转化生产 SWIR 半菁染料。通过增强供体并延长聚甲辛链以红移吸收/发射波长，并引入了叠氮基团来功能化探针。

图1. SRHCY 探针的设计概念

作者测试了探针的光物理性质。如图2b、d所示，SRHCY1-4在CH2Cl2中的吸收/发射波长分别为830/886、928/1002、1036/1103和1144/1217 nm。在醛末端的二甲基氨基反应后，成功产生了典型的“推拉”结构，通过增加共轭双键的数量，有效地减少了占据分子轨道未占据分子轨道能隙，从而将吸收和发射转移到SWIR窗口（图2c）。当共轭链增加一个共轭双键时，在吸收和发射波长上都观察到约100nm的红移。延伸共轭双键的策略也可以在另一个花青分子的聚乙炔家族中实现约100nm的红移，这表明调节共轭双键的数量对于含聚乙炔分子的波长调节是非常有效的。由于染料的多样性，能够以平衡的SWIR波长和亮度筛选分子，SRHCY-3被选为体内生物成像。

图3. Balb/c 裸鼠背部全身血管的体内实时成像

对于体内应用，通过将PEG链掺入SRHCY-3中，以获得水溶性染料SRHCY-3-PEG2000（Em=1080 nm，QY=0.04%）。与SRHCY-3（Em=1103 nm）相比，SRHCY-3-PEG2000（Em=1080 nm）的发射波长蓝移了23 nm，表明聚乙二醇化对分子核心的波长影响最小如图3所示，在静脉注射后，对麻醉的Balb/c裸小鼠进行了曝光时间（ET）为500 ms的视频速率成像，捕捉了背侧、侧面和腹侧视图。所有图像都显示了高空间分辨率、低背景和清晰的血管，这归因于1300 nm以上组织吸收、散射和自发荧光的减少。肺部是显现的器官，其次是肾脏，它们在10秒内被清晰地分辨出来，并在逐渐消退之前达到荧光强度。可实时检测整个身体的高密度血管网络并具有高信噪比，精确地描述了探针在小鼠血液中移动时的行为。SRHCY-3-PEG2000能够有效地穿透小鼠腹部的皮肤，并在注射后不久在腹侧视图中清楚地描绘出小肠和结肠部分，证明了SRHCY-3-PEG2000的高性能SWIR体内成像能力。蓝色虚线上的荧光强度分布显示，染料突出显示的血管非常清晰，由于SWIR激发和明亮的SWIR发射，峰之间明显不同。还计算了图像中峰值的半峰全宽（FWHM）（图3d-f）。血管结构的准确可视化对于实时跟踪血液循环系统至关重要，SRHCY化合物的高性能SWIR成像结果可能为未来探索血管功能障碍开辟新的可能性。

图4. 使用SRHCY-3-PEG2000胶束（100μL，5mg/kg，根据染料浓度计算）在携带A549的肿瘤小鼠中肿瘤血管的代表性时间过程图像

将SRHCY-3-PEG2000加载到胶束上（Em = 1079 nm，QY = 0.28%），是使 SWIR 分子水溶性并提高其亮度。如图4a所示，收集1300 nm 以上的高对比度肿瘤血管图像，研究尾静脉注射后肿瘤血管内分子循环的整个过程。首先观察到肿瘤的主要血管及其无序的传入血管分支。然后，致密的毛细血管变得清晰可见，而较大血管的荧光信号减弱甚至消失。证实了SRHCY-3-PEG2000胶束的高度丰富和精细的肿瘤血管成像能力。然后，还计算主要血管和毛细血管的 FWHM 值，并在图4 b/c 中标记。这些观察结果表明，纳米级SRHCY-3-PEG2000胶束可以为检测 SWIR 窗口中的微观细节提供显着的对比度。同时SRHCY-3-PEG2000的成像远远超过ICG（使用ICG几乎看不到毛细血管）。定量 SNR 分析表明SRHCY-3-PEG2000具有更高的 SNR 值。所有数据都证明了作者新设计的分子具有的光学特性。

图5. 将SRHCY-3-PEG2000（约10μL，5 mM）注入两只后足垫，对正常Balb/c裸鼠进行淋巴结的背侧SWIR荧光成像，曝光时间为 500 ms

为了进一步验证高亮度成像剂在生物医学应用中的优势，在裸鼠身上进行了淋巴管和淋巴结的成像。如图5a所示，在俯卧裸小鼠中，将荧光团皮下注射到两个脚垫中后，左/右腘LN和左/右骶LN被超高清标记。SRHCY-3-PEG2000也在尾部底部附近皮内注射，如图5c所示。注射后，高信噪比染料清晰地显示了仰卧位小鼠的淋巴管和淋巴结（图5b），这主要证明了染料在临床上寻找LN的潜在用途。临床试验使用ICG作为示踪剂，寻找外科切除和预防癌症转移的前哨LN。（59）临床医生实际上在肿瘤附近注射ICG，以观察引流肿瘤的淋巴管以及前哨淋巴结。将SRHCY-3-PEG5000或ICG皮内注射到携带A549肿瘤小鼠尾部附近。如图5d和S24-S25所示，注射后不久，SRHCY-3-PEG5000显示从大腿内侧的淋巴结内淋巴管引流到腹股沟LN，腹股沟LN可以逐渐显现。大约1小时后，腹股沟淋巴结和肿瘤之间的淋巴管变得明显。然而，12小时后，淋巴管可能由于肝脏摄取信号重叠而消失。同时，从注射后6-24小时开始，肿瘤荧光从部分明亮转变为明亮，肿瘤与肌肉的比率（TMR）增加到约3.2。至于ICG（图5e和S26–S27），淋巴管和腹股沟LN有明显的标记，但观察到的肿瘤荧光信号很小。此外，非常高的信号集中在肝脏和肠道，这与之前文献中报道的ICG的已知肝脏清除率和低肿瘤摄取率是一致的。收集淋巴管系统的横截面强度分布显示，SRHCY-3-PEG5000的淋巴特征明显更清晰（半峰全宽约为441μm），与ICG在1200 nm LP滤光片下分析给定血管时观察到的更弥漫的特征（半峰宽值为713和1623μm）形成鲜明对比（图5f）。这一结果表明，在较长波长下工作的分子，如SRHCY-3，可以比NIR-I染料获得更高的清晰度。

最初用PEG2000修饰SRHCY-3染料以实现水溶性，之后将PEG长度从PEG2000延长到PEG5000以改善肿瘤摄取。评估了SRHCY-3-PEG2000和SRHCY-3-1PEG5000的体内代谢特征和排泄途径。在Balb/c裸鼠腹部注射后的不同时间点记录SWIR荧光成像。在ICR小鼠腹部注射后，以多个时间间隔捕获SWIR荧光图像。给药后6小时，SRHCY-3-PEG5000的肝脏摄取量下降了37.5%，而SRHCY-3-1PEG2000仅下降了25.3%。此外，在6小时的时间过程中，SRHCY-3-PEG5000在膀胱中的相对SWIR荧光强度保持在约2的值，而SRHCY-3-1PEG2000在1小时后没有显示出可检测到的膀胱摄取。在24小时和48小时收集了排泄的尿液或粪便，SWIR半定量荧光分析表明，当PEG的聚合度增加时，肝脏信号减少，膀胱信号增加。最后，通过两种方法评估了SRHCY-3-PEG2000和SRHCY-3-1PEG5000的生物相容性：细胞毒性研究和小鼠重要器官的H&E染色。最初，细胞毒性试验显示，即使在高达2 mM的样品浓度下，两种探针在24小时的孵育期后对细胞也没有明显的细胞毒性作用。这表明它们具有低毒性和良好的体外细胞生物相容性。此外，包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏在内的各种器官的H&E病理切片表明，这些器官没有明显的损伤或病变。因此，探针在体内应用中是安全且生物相容的。

图7. SRHCY-1-PEG2000（100μM）、SRHCY-2-PEG2000（10μM）和SRHCY-4胶束（10μM）描绘双色和三色成像

如上所述，SRHCY是具有高吸收系数、分离良好的吸光度和高效SWIR发光的生物偶联探针；这些有价值的特性活体小鼠体内探测和区分多种成分或靶点的需要（图7a）。探索了使用探针进行多路成像的可行性。

首先，通过瘤内注射将SRHCY-1-PEG2000给予携带A549的肿瘤小鼠，以精确定位肿瘤部位。随后静脉注射SRHCY-4胶束（图7b）。注射后，立即使用660或1064 nm激发激光结合各种LP滤光片进行SWIR双色成像，这允许同时成像和区分肿瘤和腹部血管。如图7d，青色通道清晰地标记了全身血管、肺、肝，甚至腹部皮肤下的肠肠系膜血管和肠壁血管，质量很高。品红色通道仅显示肿瘤轮廓，表明良好的光谱分离。随后，放大肿瘤组织，发现血管包裹着肿瘤组织，血管信号与肿瘤信号明显分离，不受任何干扰（图7e）。评估了三个通道的光谱串扰：660 nm激光用于SRHCY-1-PEG2000通过口服给药追踪肠道，808 nm激光用于NRHCY-2-PEG2000追踪LN，1064 nm激光用于MRHCY-4胶束照亮腹部血管（图7c）。叠加后，如图7f所示，发现这三种颜色表现出相互分离和不干涉的特性，这表明SRHCY是一种非常好的多色成像组合。

随着SWIR成像在学术和临床研究中继续蓬勃发展，鉴于SWIR区域更明显的优势，追求更长波长将是一种日益增长的趋势。在这项工作中，按照结构裁剪的指导方针，在SWIR窗口中描述了一系列光谱上不同的半花菁染料，并证明了增强供体和多烯链伸长是将D-π-a特征半花菁化合物的吸收/发射从NIR-I窗口推到SWIR窗口的有效策略。这些实际的化学经验可以指导或应用于其他分子骨架，以发现新的高级SWIR荧光团。其中，SRHCY-3被筛选并应用于被动成像检测的血管系统、淋巴结/血管系统、肿瘤血管生成和皮下或原位肿瘤的成像。最重要的是，SRHCY的组合为在活体小鼠中进行多色成像提供了一种可行的方法。成像参数和造影剂设计的进一步优化可能会在未来带来更好的应用。此外，大多数长波长SWIR分子仍然受到肝脏高摄取的影响；开发可快速从体内排泄且代谢降解很少的肾透明光学试剂可能是解决这一问题的有效方法。