细胞学堂 | 超详细的凋亡检测试剂盒选择指南!
时间：2024-06-28 阅读：108
细胞凋亡（Apoptosis），作为一种深入研究的程序性细胞死亡形式，近年来已成为生物学领域的热门课题。如果你的研究涉及癌症机制与疗法、药物筛选与药理作用、生物发育、免疫学或神经科学等领域，细胞凋亡检测无疑是你实验设计中重要的一环。
在本期的细胞学堂中，我们将深入介绍不同类型凋亡检测试剂盒的相关知识，并分享一些关于如何选择凋亡检测试剂盒的经验，旨在帮助您轻松理解并为您的样本选择合适的凋亡检测试剂盒。
凋亡细胞在细胞形态和生理上与坏死细胞和正常细胞存在显著不同，其细胞膜、细胞质、细胞核、核酸以及凋亡相关蛋白都发生明显变化，具有鲜明特征。这些差异为我们提供了检测细胞凋亡的多种方法。常用的细胞凋亡检测方法包括形态学观察、细胞膜磷脂外翻检测、凋亡相关蛋白检测、DNA断裂检测、细胞周期分析等。这些方法各有特点，可以根据实验需求和条件选择合适的检测方法。
根据细胞凋亡的机制和特点，普诺赛®自主研发了Annexin V凋亡检测试剂盒、TUNEL凋亡检测试剂盒、Caspase活性检测试剂盒和线粒体膜电位(JC-1)检测试剂盒。
检测原理：Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸（PS）有高度亲和力。在正常细胞中，PS通常位于细胞膜内侧。然而，当细胞发生凋亡时，细胞膜的通透性会发生变化，细胞膜内侧的PS部分外翻，暴露到细胞膜外侧。Annexin V可通过与凋亡早期细胞胞外翻的PS结合，从而识别凋亡细胞。为了更便于检测，将Annexin V标记上荧光染料，可通过流式细胞仪或荧光显微镜等设备检测到带有荧光的凋亡细胞。细胞核染料（PI、DAPI、7-AAD）可与双链DNA特异性结合，并产生强烈的荧光。正常情况下大分子的核染料是无法透过细胞膜，由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，细胞核染料可进入细胞内对DNA进行染色，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。
检测原理：在细胞凋亡的晚期，染色体DNA双链断裂产生大量的粘性3'-OH末端。在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，脱氧核糖核苷酸与荧光素等标记物形成的衍生物可以被标记到断裂DNA的3'-末端，从而进行凋亡细胞的检测。
检测原理：Caspase是一个蛋白酶家族，通常以无活性的酶原形式存在于细胞质中。活化的Caspase会破坏一些重要的胞内蛋白，从而引发凋亡的发生。将Caspase序列特异性的多肽酶偶联至黄色基团pNA作为底物，当Caspase被活化后，它能够剪切这个底物，释放出游离的黄色基团。通过酶标仪或分光光度计测定这些黄色基团的吸光值，就可以定量评估Caspase的活性，从而间接地监测细胞凋亡的情况。
检测原理：在正常细胞中，线粒体膜电位通常较高，JC-1主要在线粒体基质中聚集，以聚合体的形式存在，可产生红色荧光。然而，在细胞凋亡的早期阶段，线粒体膜电位会显著降低，导致JC-1无法在线粒体基质中积累，主要以单体形式存在，可产生绿色荧光。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可检测到细胞膜电位的下降，可将JC-1荧光颜色的转变作为细胞凋亡早期的检测指标。
目前市售的凋亡检测试剂盒种类众多，如何选择一款匹配自己检测样本和实验条件的试剂盒至关重要。以下是两点可供参考的建议：
01
基于样本类型选择
根据具体实验设计和样本类型，选择合适的凋亡检测试剂盒。推荐您参考下方表格所示的内容，以便为您的样本类型选择适当的凋亡检测试剂盒。例如悬浮细胞或经消化下来的贴壁细胞，四种凋亡试剂盒都可考虑使用，这些试剂盒通常能够适用于不同类型的细胞样本。然而，对于组织样本，需要注意不同的试剂盒样本制备方法可能不同。使用TUNEL凋亡检测试剂盒时，需制备石蜡或冷冻切片，而使用Caspase活性检测试剂盒时，则需对组织进行机械剪碎、匀浆和裂解。
02
基于实验仪器和配置选择
不同凋亡检测试剂盒的使用需要配备对应的仪器。推荐您参考下方表格，根据实验室现有的实验仪器，选择合适的凋亡检测试剂盒。需要提醒的是，除了确认仪器是否可用，还需要了解实验仪器的具体配置，例如流式细胞仪的荧光检测通道和荧光显微镜的滤光片组等。
市售的Annexin V凋亡检测试剂盒和TUNEL凋亡检测试剂盒，有多种荧光染料组合可供选择。在选择荧光染料时，需根据仪器配置选择能够检测的荧光染料。除此之外，如果您的细胞自带荧光（如转染了荧光蛋白的细胞或使用了带荧光的药物处理细胞），在仪器配置允许的前提下，优先选择与细胞自发荧光不同检测通道的荧光染料。如果受限于仪器配置条件，无法避免荧光染料光谱重叠，要注意合理设置单染管用于调节补偿，以确保检测结果的准确性。
试剂盒种类 | 检测样本 | 检测仪器 |
Annexin V凋亡检测试剂盒 | 悬浮/贴壁细胞 | 流式细胞仪、荧光显微镜 |
TUNEL凋亡将测试剂盒 | 悬浮/贴壁细胞 | 流式细胞仪 |
细胞爬片/涂片、石蜡切片、冷冻切片 | 荧光显微镜 | |
Caspase活性检测试剂盒 | 细胞、组织 | 分光光度计、酶标仪 |
线粒体膜电位（JC-1）检测试剂盒 | 悬浮/贴壁细胞 | 荧光显微镜、流式细胞仪 |
以上是关于凋亡检测试剂盒的知识科普及选择指南，更多细胞培养和检测相关干货，请持续关注细胞学堂专栏~