基因克隆在发明后的 32 年，需求一直不断增加，但是有些小伙伴的重组质粒就是怎么样都构建不出来。其实，看似简单的传统基因克隆，可是存在着重重陷阱！美国罗林斯研究中心 （Rollins Research Center）Ichiro Matsumura 在一期的《BioTechniques》上分享了他的经验： “Why Johnny can’t clone: Common pitfalls and not so common solutions.”小编今天就把核心的 “姿势”给大家提炼出来，主要是琼脂糖凝胶电泳、酶（DNA 聚合酶、限制性内切酶、T4 连接 酶等）和试剂的使用等一些注意事项。

▲从 PCR 产物到质粒的工作流程

1.聚合酶 

DNA 聚合酶有两个对 PCR 过程不可少的附加属性，但是不利于后续克隆的步骤。第一， Taq/DNA 混合物的解离常数在室温中是 20 nM，与扩增产物的终浓度相当，因此酶往往与扩增产物同时纯化。实际上，大多数其他商用 DNA 聚合酶与 DNA 结合的更加紧密。残存的聚合酶可以阻止限制性内切酶作用于 DNA 末端，或者填补突出的部分。第二，市场上一些改造后的新型 DNA 聚合酶相比于 Taq 酶热稳定性更高，在有机溶剂和离液盐中的构象稳定性也更高，PCR 产物的纯化更加困难了。

2.割胶回收 

载体经过酶切后，需要经过凝胶纯化提高克隆效率。割胶回收对技术要求高，也很难自动化， 而且 DNA 暴露在紫外光下会大大降低转化效率。凝胶纯化的产量往往有限，因此研究人员需要消化毫克级的 DNA，才能产生最后的终产物。残留的琼脂糖或凝胶提取过程中引入的各种溶剂和盐，可能抑制后续 T4 连接酶的活性，从而降低克隆效率。另外回收效率还与片段的长短相关，小于 500bp，或者大于 4kb 的片段，加异丙醇有助于提高回收效率。

3.限制性内切酶 

限制性内切酶的出现是为了保护细菌免受噬菌体及其他入侵者。因此，限制性内切酶/DNA 底物的 KM 值相当低（米氏常数 KM 值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度，是酶的特征性常数之一。KM 值只与酶的结构、酶所催化的底物和反应环境如温度、PH、 离子强度有关，与酶的浓度无关。Km 值愈小，酶与底物的亲和力愈大）。所以“提高酶切反 应中 DNA 的浓度，这样凝胶纯化的产物才足够连接反应使用”是错误的！在这种情况下， 限制性内切酶会受到抑制，从而导致不*的消化。

4.T4 连接酶 

连接反应失败的原因有很多，但失败可能在加入 T4 DNA 连接酶之前就发生了：由于 DNA 聚合酶扩增不*导致的末端不均一、酶切不*、连接酶抑制剂或者突出的部分被补平。在某些情况下，连接反应失败可能是因为退火效率不够、反应缓冲液中的 ATP 浓度过低（室温孵育时间过长）或者酶可能变性了。T4 连接酶在室温下相当稳定，但如果被水而不是合适的 buffer 稀释后可不是如此。如果有问题，可以通过阳性对照来检测酶的完整性：

5.感受态细胞转化 

在克隆过程中，具有高效转化效率的感受态细胞至关重要，这对于之前并不高的分子克隆效率具有一定的补偿作用。最常见的两种转化方法：热激转化和电穿孔。电穿孔是*的，更重要的是，转化细胞的数量与 DNA 的量成正比，可以达到微克级别，且不会出现热激中 出现的菌株效应或者对质粒的长度有限制，所以对于困难的克隆项目，电穿孔无疑是首先选择的方法。不过虽然热激转化效率不及电穿孔，而且会因 DNA 过量（>10ng/200μl 感受态细胞）而抑制转化，但是它方便啊！“冰一冰、热一热、凉一凉、加一下再摇一摇”就搞定了，所以还是有很多人使用这个方法的！