酶切，作为一种常用的分子克隆的手段，如果应用得当，可谓宝刀屠龙，无往而不利；如果应用不当，又会步步维艰。真是让人欢喜让人忧愁。酶切，最常见的问题就是切不动和切过了。这些问题比较复杂。下面，先讲一讲切不动的问题。

切不动可能的原因：

1. 酶不匹配

解决的方法：如果是双酶切 A 和 B，预实验中必须做 A 和 B 各自的单酶切和 A+B 的双酶切, 好确认这几种酶都好用，质粒上的切点都好用。

2. 体系的问题

解决的方法：酶切尽量用大体系，如 50ul、100ul 等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油，对反应有利。

3. 酶的量太少

解决的方法：当设计一个酶切时，限制性内切酶的用量是与 DNA 分子的大小和量密切相关的。根据每种酶的单位定义，精确计算出所需的限制性内切酶的量。不要简单的套用酶说明书中的“通用酶切方案“，那个通用酶切方案是很多酶切切不动的原因。这里，小编隆重推荐一款酶切利器：3D(Double Digestion Designer)。该软件的一个主要功能就是根据不同限制性内切酶的单位定义，以及你底物 DNA 分子的大小以及 DNA 的量（ug数）来精确计算出*酶切你的 DNA 底物所需要的酶量，为*酶切提供夯实保证。

4. 酶失活 

如果限制性内切酶因为保管不当，导致酶失活或部分失活，那么依据 3D 计算出来的酶量就不能保证*酶切。解决的方法：保管好你的酶。如果过期了，就不要用了。

5.DNA 的问题 

如果制备的质粒 DNA 的质量不好（如细菌培养时间过长，质粒制备时裂解不充分或裂解时间过长等），那么对这种质粒 DNA 进行酶切时，即使酶活性正常，酶量足够，也不能实现*酶切，因为其中很多质粒 DNA 已经变性，不能被切开。

下面，给大家看一个简单的实例。 

如果要用 AcsAB + pSB1C3 对质粒 DNA 进行双酶切，以便进行某基因的克隆。 

那么，应该同时设计并进行三种酶切反应：

A: AcsAB + pSB1C3 双酶切 

B: AcsAB 单酶切 

C: pSB1C3 单酶切 

在酶切时，A，B，C 三种酶切反应都用相同的 buffer 系统，相同的 DNA 量（建议至少 0.5ug），所需的酶量用 3D 进行计算。在合适的温度（37°C）酶切 1～2 个小时，然后进行电泳分析。电泳分析时，添加两种对照：未酶切的质粒 DNA 和分子量标准（Marker）。

根据电泳的结果，就可以知道酶切是否*：

如果一切正常，*酶切后电泳的条带分布如下： 

1.单酶切(B 和 C)应该只有一条线性化的 DNA 条带，其大小与质粒的理论长度一致； 

2.未进行酶切的质粒 DNA 应该主要是一条超螺旋条带，其电泳位置应该在单酶切产生的线性 DNA 分子的前面。(有的质粒会在超螺旋条带的后面出现线性化条带和环状 DNA 条带）； 

3.双酶切的条带应该只有一条带，而且大小与单切的位置一样(注意：只有当两个酶切位点间没有大片段插入时，才如此。事实上，大部分质粒的多克隆位点都是如此)。

如果出现以下的情况，就表明有问题： 

1.单酶切后（B 和/或 C），与未酶切的 DNA 样品(D)的电泳位置一样（即依然为超螺旋） 

2.出现线性化质粒及超螺旋质粒两条带。这意味着：AcsAB 和/或 pSB1C3 未能*切开，原因可能是酶部分失活，或者质粒的质量有问题。此时，即使双酶切只出现一条线性化 DNA 条带，也可能在线性化质粒中存在大量的单酶切的载体。 用此种载体进行克隆，则在连接时会出现大量的单酶切载体的自连（载体自连的效率较双片段连接高 10 倍以上），导致大量的自连克隆，很难挑选到有插入的克隆（克隆失败）。如果出现此种现象，建议不要盲目地做下去。应该先停一停，首先逐一查找可能的原因。只有当上述两种可能的问题都解决了，才能保证*酶切，进而获得正确的克隆。

以上是酶切的常规经验，当然还是会有特例比较难做，因为其中涉及到酶量的计算，Buffer 的选择，反应体积，反应条件等多种条件摸索。一旦出现问题，大家需要耐心细致，逐一查找可能的原因。