荧光原位杂交技术
时间：2021-12-24 阅读：1318
原理
材料与仪器
人的MyoD1（MYF3)基因探针 人外周血中期染色体细胞标本
指甲油 甲酰胺 氯化钠 柠檬酸钠 氢氧化钠 吐温20
恒温水浴锅 培养箱 染色缸 载玻片 Nikon E-400荧光显微镜 盖玻片 封口膜 200μL移液器 暗盒
步骤
3. 杂交
注意事项
相关溶液的配制
1.20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g柠檬酸钠，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH调pH 至7.0）。
2.去离子甲酰胺（DF）：将10 g混合床离子交换树脂加入100 mL甲酰胺中。电磁搅拌30 min，用Whatman l号滤纸滤。
3.体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35 mL甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。
4.体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100 mL甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。
5.体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
6.杂交液：8 μL体积分数25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL体积分数50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O混合）取上述混合液50 μL，与5 μL DF混合即成。其终浓度为体积分数10% DS，2×SSC，体积分数50% DF。
7.PI/antifade溶液
PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL双蒸水，使终浓度为2.5 μg/mL。Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10 mg/mL，用0.5 mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混匀。
PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1:9比例充分混匀，——20℃保存备用。
8.DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液，按体积比1:300，以antifade溶液稀释成工作液。
9.封闭液I：体积分数5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。
10.封闭液II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。
11.荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。
12.洗脱液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。
常见问题
相关溶液的配制
1.20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g柠檬酸钠，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH调pH 至7.0）。
2.去离子甲酰胺（DF）：将10 g混合床离子交换树脂加入100 mL甲酰胺中。电磁搅拌30 min，用Whatman l号滤纸滤。
3.体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35 mL甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。
4.体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100 mL甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。
5.体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
6.杂交液：8 μL体积分数25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL体积分数50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O混合）取上述混合液50 μL，与5 μL DF混合即成。其终浓度为体积分数10% DS，2×SSC，体积分数50% DF。
7.PI/antifade溶液
PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL双蒸水，使终浓度为2.5 μg/mL。Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10 mg/mL，用0.5 mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混匀。
PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1:9比例充分混匀，——20℃保存备用。
8.DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液，按体积比1:300，以antifade溶液稀释成工作液。
9.封闭液I：体积分数5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。
10.封闭液II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。
11.荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。
12.洗脱液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
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