1、样本准备过程中防止蛋白质降解和保留翻译后修饰

     样本准备过程中，细胞会释放蛋白酶和/或去磷酸化酶，为了减少这些酶的活性，处理样本的过程应在冰上进行，并预先冷却所有缓冲液，并且建议用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液。

2、磷酸化特异性抗体的选择

     选择磷酸化特异性抗体时，选择所要检测位点的磷酸化抗体至关重要。磷酸化都会使蛋白质的分子量增加80Da，检查抗体是否检测到磷酸化靶蛋白的分子量正确的条带也很重要。

3、诱导磷酸化

     课题设计可能需要在收获前刺激细胞，以确保蛋白质被磷酸化。 例如，在特定细胞信号传导途径激活后，靶蛋白可能在目的位点被磷酸化。

4、浓缩样品

     当观察相对罕见的磷酸化事件时，可以使用最小体积的裂解缓冲液来裂解样品达到浓缩的目的。 如果目的蛋白质的亚细胞位置已知，例如，如果您的蛋白质位于细胞核中，您可以先进行细胞分级分离，仅将细胞核裂解组份进行蛋白质印迹实验。 您也可以考虑使用针对您感兴趣的蛋白质的抗体进行免疫沉淀（IP），而不管磷酸化状态如何。

5、优化封闭液

     为您的抗体选择最佳的封闭试剂。 对于磷酸化分析，可以从含酪蛋白或BSA的TBS缓冲液开始。 使用牛奶会导致更高的背景，因为它含有的蛋白质可能会干扰磷酸化蛋白质的目标检测。 其他封闭试剂如鸡卵清蛋白，鱼明胶和市售合成封闭试剂也可提供可行的替代方案。 在计划磷酸化蛋白质印迹实验时，重要的是要记住，没有一种适合所有样品的封闭液。

6、转印膜的选择

     可以将蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上。 PVDF膜具有高机械强度，需要膜剥离和再杂交时使用，通常情况下，当您使用总蛋白作为磷酸化靶标的上样对照时。 由于PVDF具有比硝酸纤维素更高的结合能力，因此优选用于低丰度的磷酸化靶标。 然而，PVDF的结合能力增强也意味着与硝酸纤维素相比，您有可能看到更高水平的非特异性结合和背景。 如果您正在进行全蛋白内参归一化或使用荧光二抗，建议使用低荧光背景PVDF（LF PVDF）膜。

7、洗涤

     用于执行洗涤步骤的缓冲液的类型也可以对信号与背景产生影响。 通常，与基于磷酸盐缓冲液（PBS）相比，使用基于tris缓冲液（TBS）通常可以产生更强的信号。 注意，PBS中磷酸根离子的存在可能干扰来自磷酸化靶蛋白的信号。 在洗涤缓冲液中加入Tween-20等洗涤剂也有助于去除非特异性结合在膜上的物质。

8、总蛋白质的检测

     使用检测目标蛋白总水平的抗体，可以确定相对于总目标蛋白的磷酸化比例。这使您可以比较不同处理的影响，并提供内参。

9、总蛋白内参归一化

     总蛋白内参归一化是一种用于量化目标蛋白质丰度的技术。这涉及将条带灰度值按照样品中总蛋白质进行标准化。

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