Highly efficient transgene-free targeted mutagenesis and single-stranded oligodeoxynucleotide-mediated precise knock-in in the industrial microalga Euglena gracilis using Cas9 ribonucleoproteins

利用Cas9核糖核酸蛋白在工业微藻中实现高效无转基因靶向诱变和单链寡脱氧核苷酸介导的精确敲入

2019 年 5 月 26 日，在Plant Biotechnology Journal 杂志发表了一篇论文" Highly efficient transgene-free targeted mutagenesis and single-stranded oligodeoxynucleotide-mediated precise knock-in in the industrial microalga Euglena gracilis using Cas9 ribonucleoproteins  "，文章中将CRISPR/ Cas9系统的基因编辑技术应用于纤细裸藻中，为阐明其他微藻类的基因功能提供了一个突破。

纤细裸藻是一种单细胞光合鞭毛虫，也是一种工业开发的微藻，它富含营养元素，积累大量的裸藻淀粉，具有多种生物活性功能。因此，大量培养的纤细裸藻是功能性食品、饲料和化妆品的商业来源。此外，在厌氧条件下，裸藻淀粉可被降解并转化为主要由肉豆蔻酸和肉豆蔻醇组成的蜡酯。由于纤细裸藻产生的蜡酯很容易转化为具有低冰点的生物燃料，因此它适合作为生物喷气燃料的来源。

纤细裸藻（又名小眼虫，Euglena  gracils）

在文章中，研究者为了在纤细裸藻中建立了一种基于Cas9核糖核酸蛋白（RNPs）的无转基因诱变方法，在纤细裸藻葡聚糖合成酶2（EgGSL2）基因的第二个外显子内设计了两个靶序列，他们推测该基因可能参与了裸藻淀粉的生物合成。使用NEPA GENE电转仪将Cas9核糖核酸蛋白导入到纤细裸藻细胞中（图1b）。实验结果表明，这两种以EgGSL2为靶点的RNPs可以使纤细裸藻细胞表现出更少但更大的裸澡淀粉颗粒。靶1和靶2表型改变的平均频率分别为71.3%和80.6%(图1d)，并且在电穿孔后72h检测，插入缺失突变率分别为77.7-86.8%和88.8-90.1%（图1g）。

纤细裸藻作为一种可再生资源具有很多优异特性，但想要建立其有效靶向诱变一直是一个长期的挑战。在这里，研究者利用CAS9 RNPS开发了一种高效的无转基因靶向诱变和单链寡核苷酸介导的基因敲入，这将为纤细裸藻是一种可编辑基因组的有机体提供了第一个证据，利用裸藻中所含的副淀粉和脂肪酸合成了生物塑料，为纤细裸藻开发应用开拓了新方向，同时促进生物材料生产的可持续性发展。

文章采用的是NEPA21 电转染仪来进行电转，采用全新的四步法电转程序，配合多脉冲、电压衰减（Voltage Decay）和辅助基因导入模式设计，可在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率 ，并且不需要特殊转染试剂辅助。