ViralStars LP LentivirusPackagingKit

　　CatalogNumber：LP110

01/ViralStars 慢病毒包装试剂盒产品概述

　　慢病毒是一种有包膜的RNA病毒，直径为80-120nm，呈二十面体对称结构、球形。病毒颗粒最外层是包膜（包膜蛋白决定了感染细胞的类型），再往里依次为基质蛋白和衣壳，最里面是两条相同的正股RNA链和酶（逆转录酶、整合酶和蛋白酶）。

　　慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供包装重组慢病毒载体所需的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接或浓缩后用于宿主细胞的感染。

　　慢病毒感染细胞的第一步是通过包膜蛋白与细胞表面受体结合。慢病毒与宿主细胞膜融合后释放结构蛋白、酶蛋白和病毒核心。病毒RNA在逆转录酶的作用下逆转录并与整合酶形成整合前复合物。整合前复合物进入细胞核后，整合酶催化其整合至宿主基因组。整合后的DNA转录为mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰。

　　ViralStars慢病毒包装试剂盒LentivirusPackagingKit属于第二代慢病毒包装体系，同时可兼容第二代和第三代慢病毒包装质粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒，即产生的慢病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。ViralStarsLPTMLentivirusPackagingKit包装的慢病毒具有感染效率高、感染谱广等特点，可实现外源基因在宿主细胞中的稳定持续表达。经该试剂盒包装获得的对照质粒病毒滴度可达108TU/mL。

　　ViralStars慢病毒包装试剂盒包含如下组分：

　　(1)优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物（PackagePlasmidMix），经过设计调整，可兼容大多数慢病毒表达载体，确保将重组子包装成具有高感染率的慢病毒颗粒。

　　(2)表达GFP和Puro标记的对照质粒（ControlPlasmid），便于观察病毒包装效率及测定病毒滴度。

　　(3)高效转染试剂（PolyShooterTransfectionReagent），具有更高的转染效率和更低的细胞毒性。

　　(4)常用病毒感染增强试剂Polybrene，能够显著提高病毒与细胞的接触及感染效率。

02/产品组分

03/保存条件：冰袋（wetice）运输。-20℃保存，有效期12个月。

04/产品特点

　　简单快速——操作简单，无需对包装辅助质粒进行抽提，也无需对包装体系进行优化

　　病毒滴度高——可包装出高滴度、高表达水平的慢病毒

　　应用范围广——经过设计及优化配比，兼容大多数慢病毒表达载体

05/实验流程概要

06/ViralStars 慢病毒包装试剂盒实验步骤

一、重组慢病毒制备

　　1.细胞准备

　　转染前一天，将4-6×106个293T细胞接种到10cm细胞培养皿中，使其在包装时密度为70%-80%，放置于37℃，5%CO2培养箱培养16h～24h。

　　Ø细胞状态会极大影响病毒包装效率，待包装细胞应处于良好生长状态，建议使用生长处于指数期、存活率大于90%的细胞进行慢病毒包装。

　　Ø该包装系统与ViralStarsTMLentivirusPackagingCellLine（CL110001）配合使用，可包装出更高滴度、更高表达水平的慢病毒。

　　2.慢病毒包装

　　(1)取10μL慢病毒包装辅助质粒混合物（PackagePlasmidMix）加入到2mL离心管中，加入2.5μg含有目的基因的慢病毒载体质粒，轻轻混合，加入32μLPolyShooter转染试剂与质粒混合，室温孵育3分钟。

　　Ø慢病毒载体质粒需根据研究基因自行构建，应使用无内毒素质粒抽提试剂盒进行质粒提取，保证质粒A260/A280比值为1.8-2.0，浓度不低于500ng/μL。溶解后的质粒切忌反复冻融，需按照使用量进行分装并于-20℃保存。

　　(2)往上述混合物中加入1.8mL无血清无双抗的DMEM基础培养基，轻轻混匀，在室温下静置30分钟，形成转染试剂-核酸复合物。

　　Ø转染试剂-核酸复合物在室温下4个小时内保持稳定。

　　(3)将上述1.8mL转染试剂-核酸复合物轻轻地逐滴均匀加入10cm皿293T细胞中，轻轻摇动培养皿混匀，置于37℃，5%CO2培养箱中培养产毒。

　　3.收获病毒

　　(1)转染24h后，可选择弃去初始病毒上清液，加入10-15mL新鲜的*培养基(DMEM+10%FBS)至10cm细胞培养皿中，置于37℃，5%CO2培养箱继续培养(此步骤可选)。

　　(2)转染48h后，收集病毒上清液，再加入10-15mL新鲜的*培养基(DMEM+10%FBS)至10cm细胞培养皿中，置于37℃，5%CO2培养箱继续培养。

　　(3)转染72h后，观察细胞状态并拍照，进行二次病毒上清液收集，与48h收集的上清液混合，300xg离心10分钟以除去细胞碎片，使用0.22μm滤器过滤，过滤后的上清液可直接感染目的细胞，或使用慢病毒浓缩试剂盒(LC110R)浓缩后感染目的细胞。

　　Ø切忌反复冻融病毒，冻融一次病毒滴度将降低10-20%。-80℃保存的慢病毒最好在半年内使用。

二、VirusStars慢病毒包装试剂盒LP110病毒滴度测定

　　1.孔稀释法标定带荧光的重组慢病毒滴度

　　(1)Day1：准备细胞

　　对生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至
1-3x105个
/mL
，加入96孔板，100
μL/孔（1-3x104个
/孔），每⼀种慢病毒设6个梯度孔，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

　　(2)Day2：病毒的稀释与感染

　　在EP管中做10倍梯度稀释，连续6个稀释梯度。稀释方法如下：准备6个⽆菌EP管，每个EP管中加⼊90μL新鲜的*培养基（含10μg/mLpolybrene），取待测定病毒液10μL加⼊到第⼀个EP管中（标记10μL），混匀后取10μL病毒稀释液加⼊到第⼆个EP管中（标记1μL），以此类推，直到稀释到最后⼀管。弃去96孔板中原有的培养基，将稀释好的病毒依次加入孔中，并做好标记，⼩⼼操作，不要吹起细胞，置于培养箱中培养16h。如需设置复孔，则按复孔的数量倍数增加以上用量。

(3)Day3：弃病毒，换液吸去含病毒的培养基，在每个孔中再加入
100μL
预热的新鲜*培养基。

　　(4)Day4：荧光计数与滴度计算

　　方法1：末位稀释计数法

　　感染36-48h后，用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数。数出最后两孔的荧光细胞数(若设置了复孔，则计算复孔内的总数之和并计算出平均数)，假设为A(倒数第二孔的荧光细胞数）和B（倒数第一孔的荧光细胞数)。

　　慢病毒滴度计算公式1：病毒滴度(TU/mL)=（A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μL）

　　举例1：5号管对应的荧光阳性细胞数为10个，6号管对应的荧光阳性细胞数为2个，则病毒滴度为：

　　滴度（TU/mL）=
（
10+2x10）x1000/2/0.001
=
1.5x107

　　如果需要感染
2x105个细胞，MOI=5（1个细胞对应5个病毒颗粒），则需病毒体积为：

　　所需病毒体积
=
2
x105x
5/1.5x107（mL）=
0.067
mL
=
67
μL

　　方法2：适量荧光计数法

　　感染36-48h后，用荧光显微镜或流式细胞术对荧光比例合适（10%-50%）的连续两个梯度进行统计，数出两孔的荧光细胞数(若设置了复孔，则计算复孔内的总数之和并计算出平均数)，假设为C（较高浓度孔的荧光细胞数）和D（较低浓度孔的荧光细胞数）。

　　慢病毒滴度计算公式2：病毒滴度(TU/mL)=（C+D×10）×1000/2/C孔病毒量（μL）

　　举例2：3号管对应的荧光阳性细胞数为10000个，4号管对应的荧光阳性细胞数为2000个，则病毒滴度为：

　　滴度（TU/mL）=
（
10000+2000x10）x1000/2/0.1
=
1.5x108

　　如果需要感染
2x105个细胞，MOI=30（1个细胞对应30个病毒颗粒），则需病毒体积为：

　　所需病毒体积
=
2
x105x
30/1.5x108（mL）=
0.04
mL
=
40
μL

　　2.相对定量PCR标定非荧光的重组慢病毒滴度

　　(1)Day1：准备细胞

　　对生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1-3x105个
/mL
，加入24孔板，500
μL/孔（
0.5-1.5x105个
/孔），每⼀种慢病毒设6个梯度孔，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

　　(2)Day2：病毒的稀释与感染

　　在EP管中做10倍梯度稀释，连续6个稀释梯度。稀释方法如下：准备6个⽆菌EP管，每个EP管中加⼊450μL新鲜的*培养基（含10μg/mLpolybrene），取待测定病毒液50μL加⼊到第⼀个EP管中（标记50μL），混匀后取50μL病毒稀释液加⼊到第⼆个EP管中（标记5μL），以此类推，直到稀释到最后⼀管。弃去24孔板中原有的培养基，将稀释好的病毒依次加入孔中，并做好标记，⼩⼼操作，不要吹起细胞，置于培养箱中培养16h。如需设置复孔，则按复孔的数量倍数增加以上用量。

(3)Day3：弃病毒，换液吸去含病毒的培养基，在每个孔中再加入
500μL
预热的新鲜*培养基。

　　(4)Day4：相对定量PCR与滴度计算

　　用PBS清洗并将细胞吹打下来，离心收集细胞，进行基因组DNA的提取，qPCR检测。以被测慢病毒载体梯度稀释为标准品，慢病毒载体上的通用引物进行qPCR以获得病毒整合拷贝数。以Actin质粒梯度稀释为标准品，Actin引物进行qPCR检测样品的基因组拷贝数以得到基因组拷贝数。

　　慢病毒滴度计算公式3：滴度（IU/mL）=(E×N×1000)/对应孔病毒量（μL），其中E=平均每基因组慢病毒整合拷贝数，N=感染时细胞的数目（约为1.5×105）。

　　Ø测定时，设置一组带荧光的已知TU的慢病毒作为对照，以校验检测出的数值。

三、慢病毒感染目的细胞

　　VSVG包膜蛋白对不同的细胞和组织的亲嗜性有很大差异，在使用慢病毒感染目的细胞之前，需要查阅相关文献或进行预实验确定目的细胞的复感染指数（MOI，multiplicityofinfection）。

　　1.按照上述步骤包装慢病毒及确定慢病毒滴度，通过病毒滴度和MOI计算所需病毒量（计算公式参考06/实验步骤/病毒滴度测定）。

　　2.实验前一天，将生长状态良好的目的细胞消化计数后稀释至1-3×105/mL，加入12孔板，1mL/孔。放入37℃，5%CO2培养箱中培养。

　　Ø悬浮细胞不需要提前一天接种，实验前将细胞计数接种后，直接加入病毒混合液即可。

　　3.配制慢病毒+polybrene+培养基混合液。polybrene为常用的促感染试剂，能够显著提高病毒与细胞的接触及感染效率，一般使用浓度为2-10μg/mL，但对某些细胞（如末端分化的神经元，DC细胞等）毒性较大，初次使用建议先做毒性测试。

　　4.吸去12孔板中目的细胞的培养基，加入3中配制的慢病毒混合液，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养。

　　Ø感染悬浮细胞或半悬浮细胞，则需采用平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养板后，封好口，放入平角离心机中，低速（200xg）离心
1h
，然后放入培养箱中继续培养。

　　Ø若实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，加入适量的病毒液，室温放置
15min，然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养板中继续培养。

　　5.病毒感染16h后更换为新鲜培养基继续培养。

　　6.病毒感染36-48h后，荧光显微镜下观察荧光表达情况。

　　7.若表达效果不理想，可调整MOI（例如，设置MOI梯度）再次检测。

　　07/适用范围

　　兼容大多数慢病毒表达载体，经过设计及优化配比，确保将重组子包装成具有高感染率的慢病毒颗粒，同时防止病毒的自我复制。

08/注意事项

　　1.该系统与ViralStarsLentivirusPackagingCellLine（CL110001）配合使用，可包装出更高滴度、更高表达水平的慢病毒。

　　2.在收获粗病毒后，建议额外分装几支20-100µL小体积管，和其他分装的大体积病毒一并置于-80℃保存。待这些小体积病毒结冰后，取出来融化，再测定滴度。这一步可以模拟一次冻融带来的活性滴度下降，这样测得的滴度才是真正具有参考价值的。

　　3.为了您的健康安全，请规范操作，穿戴实验服与手套开展实验。

　　4.所有慢病毒操作均需在生物安全柜（BSL2级）中进行。

　　5.本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及治疗。

　　09/实验案例分析

　　1.提前一天使用10cm细胞培养皿培养ViralStarsLentivirusPackagingCellLine（CL110001），待细胞密度为75%左右开始包装慢病毒。

　　2.使用ViralStarsTMLPLentivirusPackagingKit（LP110-10）进行慢病毒包装。取10μL慢病毒包装辅助质粒混合物（PackagePlasmidMix）加入到2mL离心管中，加入2.5μL表达GFP的对照质粒（ControlPlasmid），轻轻混合，加入32μLPolyShooter转染试剂与质粒混合，室温孵育3分钟。

　　3.往上述混合物中加入1.8mL无血清无双抗的DMEM基础培养基，轻轻混匀，在室温下静置30分钟，形成转染试剂-核酸复合物。

　　4.将上述1.8mL转染试剂-核酸复合物轻轻地逐滴均匀加入10cm皿慢病毒包装细胞中，轻轻摇动培养皿混匀，置于37℃，5%CO2培养箱中培养产毒。

　　5.转染24h后，弃去初始病毒上清液，加入10mL新鲜的*培养基(DMEM+10%FBS)至10cm细胞培养皿中，置于37℃，5%CO2培养箱继续培养。

　　6.转染48h后，收集病毒上清液，再加入10mL新鲜的*培养基(DMEM+10%FBS)至10cm细胞培养皿中，置于37℃，5%CO2培养箱继续培养。

　　7.转染72h后，观察细胞状态并拍照，进行二次病毒上清液收集，与48h收集的上清液混合后，300xg离心10分钟以除去细胞碎片，0.22μm滤器过滤，使用ViralStarsLCLentivirusConcentrationSolution慢病毒浓缩试剂盒（LC110R）进行20倍浓缩，使用1mLViralStarsLSLentivirusStorageSolution（LS110R）重悬慢病毒颗粒。

　　8.孔稀释法测定病毒滴度（参考06/实验步骤中病毒滴度测定方法），使用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，并拍照记录，实验结果如图2所示。