PolyShooter INTERFERE Transfection Reagent

For the transfection of siRNA/miRNA into animal cells

CatalogNumber：P09410

01/产品概述

　　RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是近年来生命科学领域重大的发现之一，它是指小分子双链RNA可以特异性地降解同源mRNA，从而抑制或关闭特定基因表达的现象。人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（SmallinterferingRNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤等基因治疗领域。RNAi是目前热门的生命科学研究领域，也是未来有发展前途的新药开发领域。除此之外，RNAi技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。

　　 siRNA/miRNA导入有以下几种方法∶化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。化学转染技术是目前常用的方法，化学转染能否成功的关键在于转染试剂的选择。

　　 PolyShooter siRNA/miRNA 转染试剂 P09410，即PolyShooter INTERFERE Transfection Reagent是一种基于阳离子高分子聚合物的新型转染试剂，适用于siRNA和miRNA的转染。其原理为带正电的高分子聚合物与siRNA/miRNA带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后，与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞，形成内含体。该转染试剂具有质子海绵的作用，能够吸收溶酶体中的H+，质子的不断流入导致复合体肿胀破裂，从而使外源siRNA或miRNA释放到细胞质中，实现siRNA/miRNA的细胞转染。

　　PolyShooter siRNA/miRNA 转染试剂 P09410 对多种常见细胞具有高水平转染效率，具有高效低毒、操作简单、重复性好等优点，适用siRNA/miRNA介导的基因抑制实验。其*的配方使其转染后无明显细胞毒性，因此无需去除转染试剂-核酸复合物或更换新鲜培养基，也可根据具体情况优化转染体系。

02/产品组分

03/保存条件

冰袋（wetice）运输。4℃保存，有效期6个月。-30℃至-10℃保存，有效期12个月，避免反复冻融。

04/产品特点

　　转染效率高——针对广泛类型的细胞，均表现出优秀的转染效率，基因抑制效果好，脱靶效应低

　　细胞毒性低——作用温和，能较好地实现高转染效率与低细胞毒性之间的平衡

　　适用范围广——可用于多种细胞类型，适合siRNA/miRNA介导的基因抑制实验

　　操作简单——简单快速的实验方案，可获得稳定的结果，且转染后无需去除复合物或更换新鲜培养基

05/适用范围

　　LeapWal PolyShooter siRNA/miRNA 转染试剂是一种基于阳离子高分子聚合物的新型转染试剂，适用于siRNA和miRNA的转染。

06/实验流程概要

07/实验步骤（以24孔板为例，其他培养板加样体积参考表一：转染量度标准）

1: 准备待转染细胞

贴壁细胞：转染前一天，将胰酶消化后的细胞按照每孔0.1-1x10⁵个细胞的量进行铺板，使其在转染时密度为30%-40%。

悬浮细胞：转染当天，配制转染试剂-核酸复合物之前，在24孔板中进行细胞铺板，每500 µL生长培养基中加入0.5-2.5x10⁵个细胞。

Ø 细胞状态会极大影响转染效率，待转染细胞应处于良好生长状态，建议使用生长处于指数期、存活率大于90% 的细胞进行转染。

2: 准备PolyShooter^TM INTERFERE转染试剂-核酸复合物

（1）取1 μL siRNA (20 μM，DEPC水溶解) 加入到1.5 mL离心管中，加入2 μL PolyShooter^TM INTERFERE转染试剂与siRNA混合，室温孵育3分钟。

Ø 基因性质、细胞类型、siRNA效价、靶mRNA的半衰期和靶蛋白的周转率等因素均会影响siRNA的转染效率，建议选取siRNA作用浓度在10-100 nM之间，转染试剂的体积应根据siRNA浓度和培养皿的大小进行调整，请参见表一。

（2）往上述混合物中加入100 μL Opti-MEMTM I减血清培养基（无血清无双抗），轻轻混匀，在室温下静置30分钟，形成转染试剂-核酸复合物。

3: siRNA细胞转染

30分钟后，将上述100 µL转染试剂-核酸复合物加入每孔细胞，轻轻摇动培养板混匀。

4. 分析转染细胞的基因干扰效率

转染细胞培养24-48小时后，可根据实际情况用RT-PCR、Western Blot、ELISA、荧光检测法、流式细胞术、报告基因等检测基因干扰效果，或进行后续功能实验。

Ø 该转染试剂也适合转染miRNA，具体操作请参考siRNA的操作流程。

表一：转染量度标准

08/注意事项

1.核酸质量：确保siRNA/miRNA是经过PAGE纯化和脱盐处理的，高纯度的siRNA/miRNA有助于获得较高的转染效率。

2.细胞质量：细胞状态会极大影响转染效率，建议使用生长处于指数期、存活率大于90%的细胞进行转染。

3.细胞密度：建议细胞传代后12-24h内、细胞密度为30%-40%时进行转染。不同的细胞转染实验，对细胞密度的要求不尽相同。在进行不同核酸或不同细胞系的转染时，需要根据说明书再次优化实验条件。此外，在实验过程中保证相同的接种条件，确保实验数据的可重复性。

4. siRNA与转染试剂使用比例：对于大多数细胞系而言，转染复合物中siRNA (μL of 20 μM Stock)与PolyShooter^TM INTERFERE Transfection Reagent (μL) 的比例在1：1至1：3之间，推荐比例为1:2。想要获得理想的基因干扰结果，需要对这一比例进行优化，根据所转染细胞及siRNA选择适合的转染比例。

5. 由于一些特殊培养基中的某些成分可能会抑制阳离子聚合物介导的转染，因此有必要检测特殊培养基与PolyShooterTM INTERFERE Transfection Reagent的相容性。

6. 转染前，确保siRNA/miRNA基因沉默表达不会影响细胞活力。

7. 您需要设计针对目的基因的若干siRNA（小干扰RNA），并评估其效价。

8. 整个实验过程使用无RNA酶和无热原性的材料，如离心管、枪头、缓冲液。

9. 为了您的健康安全，请规范操作，穿戴实验服与手套开展实验。

10. 本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及治疗。

09/实验案例分析

1: 转染前一天，将稳定表达GFP的HeLa细胞接种于24孔板，使其在转染时密度为30%。

2: 按照每孔计量，取1μL siRNA(GFP/NC, 20 μM)加入到1.5 mL离心管中，再加入2 μL PolyShooterTM INTERFERE Transfection Reagent与siRNA进行混合，室温孵育3 min。

3: 往上述混合物中加入100 μL Opti-MEM^TM I减血清培养基（不含血清不含双抗），轻轻混匀，在室温条件下静置30 min，形成PolyShooter^TM INTERFERE转染试剂-核酸复合物。

4: 30分钟后，将上述100 µL转染试剂-核酸复合物加入每孔细胞，轻轻摇动培养板混匀。

5: siRNA转染细胞24小时后，用荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP绿色荧光蛋白干扰效果，实验结果如图2所示。

6: 说明：此次实验选择商业化的 siRNA转染试剂RNAiMAX作为对照组，RNAiMAX的具体实验操作按照其说明书进行。简单来说：在不含抗生素的50 μL 无血清Opti-MEM 培养基中稀释1μL siRNA(GFP, 20 μM)，轻轻混匀。然后，在不含抗生素的50 μL 无血清Opti-MEM 培养基中稀释1μL RNAiMAX，轻轻混匀。将稀释的siRNA与稀释的RNAiMAX轻轻混合，在室温下孵育20分钟。将混合物添加到细胞中，其终体积为600μL。siRNA转染细胞24小时后，用荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP绿色荧光蛋白干扰效果。

图2: siRNA转染细胞24 h后，荧光显微镜(A)及流式细胞仪(B)检测GFP干扰效果

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