准确定量分析基因治疗制剂中转染剂聚乙烯亚胺（PEI）残留
时间：2022-02-15 阅读：6038
生物制药领域的浪潮，从单抗、双抗、ADC 等抗体药物的研发拓展到基因治疗和细胞治疗，以及现在异常火热的 mRNA 疫苗领域和寡核苷酸药物等。
聚乙烯亚胺（PEI）是一类阳离子聚合物转染载体，在基因治疗方法开发与生产中，可通过瞬时基因表达生产重组蛋白质，还可以在贴壁细胞系中用于病毒载体生产（腺相关病毒、慢病毒、腺病毒等）。具有基因转染效率高，易于从溶酶体中逃逸等优点。但是 PEI 具有一定的毒性，其不易在体内生物降解的缺点受到了研发人员的关注，因此大家会严格控制 PEI 在基因治疗制剂中的残留，将潜在的风险降到低。为了满足大家对 PEI 痕量残留监控的急切需求，我们开发了 HPLC-ELSD 方法准确定量分析制剂中转染剂 PEI 的残留。
什么是 PEI？
PEI 是水溶性高分子聚合物的化学结构，没有显著的紫外吸收的基团，且带有大量的正电荷。基于此特性，安捷伦推出液相色谱-蒸发光散射（HPLC-ELSD）联用技术，适用于分析无法通过紫外检测器进行测定的半挥发性及非挥发性化合物，特别是对于缺乏紫外吸收基团且不易挥发的 PEI 有较高的灵敏度和较好的重现性。
实验样品分析
准备 PEI 的对照品溶液，可以看到不同分子量的 PEI(PEI-25kDa和PEI-40kDa)在安捷伦 Poroshell HPH-C18 色谱柱上均有较好的保留。
图 1 不同分子量 PEI 的色谱图
PEI 为了准确定量实际样品溶液中 PEI 的残留，我们配制了一系列不同浓度的 PEI 对照品溶液，绘制标准曲线。
图 2 一系列不同浓度的 PEI 色谱图
图 3 PEI 标准曲线（浓度范围 0.01-0.1 mg/mL）
在此色谱条件下，PEI 在 ELSD 检测器上有较高的灵敏度，浓度 0.001 mg/mL，可以得到 S/N=42，*测定制剂中痕量 PEI 残留的要求。
图 4 浓度 0.001 mg/mL PEI 的色谱图
在实际样品分析过程中，制剂中含量较高的缓冲盐，以及前处理后残留的其他物质在色谱柱上没有保留，在死时间出峰，而 PEI 与色谱柱具有较强的作用力，通过快速的有机溶剂梯度变化进行洗脱，可以得到很好的分离，PEI 的加标回收率在 90%-110%之间。
图 5 实际样品及加标样品色谱图
该方法分离度好，灵敏度高，具有良好的线性关系、精密度和准确度，保留时间和峰面积的 RSD 分别在 0.1%和 1.6%范围内。
利用上面的 HPLC-ELSD 分析方法，可以很好地满足目前对制剂中痕量 PEI 残留的分析，同时考虑到实际样品基质比较复杂，在色谱柱之后和 ELSD 之前，安装多功能阀，通过软件设置切换时间，将 4min 之前高浓度基质切换到废液中，4min 之后待测 PEI 切到 ELSD 中进行检测。既准确测定了痕量 PEI，又避免了基质污染 ELSD 检测器，保证了该方法的重现性。
推荐仪器
HPLC-ELSD 联用技术采用全新 1290 Infinity II ELSD 检测器，包括特殊光电倍增管以及激光器件，使其在灵敏度提高的同时，动态范围提高 90 倍，而且其*的高精度玻璃喷头设计为峰面积重现性提供了保证。
液相色谱-蒸发光散射检测器
出色的灵敏度
新的 1290 Infinity II ELSD 检测器配置性能出众的激光光源，灵敏度比常规 ELSD 高出 10 倍，更适用于痕量分析。
极佳的稳定性
经过优化的安捷伦 ELSD 检测器具有出色的稳定性，使大部分分析物获得优异的重现性，提供可靠、准确的分析结果。
结语
与此同时，为满足国内迅速发展的生物制药行业对辅料、工艺残留和递送载体等分析提出的更高要求，安捷伦应用实验室开发出一系列解决方案，包括 mRNA 疫苗和寡核苷酸药物递送载体的分析，治疗性蛋白药物制剂中表面活性剂吐温 20 或吐温 80 、稳定剂泊洛沙姆 188、冻干保护剂蔗糖、氨基酸等辅料成份的分析；以及消泡剂（二甲基硅油）和裂解剂（Triton X-100）等生产工艺残留分析。
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1 采用 Agilent 1290 Infinity II ELSD 同时定量分析治疗性蛋白药物制剂中吐温 80 （聚山梨酯 80）和泊洛沙姆 188
2 使用高效液相色谱-蒸发光散射检测器 (HPLC-ELSD) 对生物制剂中的泊洛沙姆 188 进行定量分析
3 安捷伦生物制药辅料及生产工艺残留分析解决方案
4 使用反相高效液相色谱-蒸发光散射法 (RP-HPLC-ELSD) 对 PEG 偶联重组蛋白注射剂中的吐温 20（聚山梨酯 20）进行分析