皖仪科技液相色谱测定药品中有效成分含量

返魂草为我国长白山地区的特色资源之一，收载于中国药典2020年版第四部“成方制剂中本版药典未收载的药材和饮片”，为菊科千里光属植物的干燥全草，包括全叶千里光和麻叶千里光 ,具有清热化痰、镇咳平喘功效 ,其主要活性成分是以绿原酸为代表的有机酸类和以金丝桃苷为代表的黄酮类。祛风止痛胶囊是由老鹳草、槲寄生、续断等药材组成的中药复方制剂，该药具有祛风镇痛、舒筋活血、强壮筋骨的功效,用于四肢麻木、腰膝疼痛、风寒湿痹等症。处方中续断具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏、安胎等功效,其有效成分为川续断皂苷Ⅵ。

本文采用高效液相色谱法分别对返魂草中绿原酸、金丝桃苷含量以及祛风止痛丸中续断的有效成分川续断皂苷Ⅵ含量进行测定,均取得满意效果。

1 实验方法

1.1 仪器配置

          表1. 高效液相色谱系统配置清单

1.2 试剂及实验材料

1.2.1 返魂草

乙腈：色谱纯；

甲醇：色谱纯；

绿原酸（标准品）：(100μg/mL in Methanol)；

金丝桃苷（标准品）：(98.0%)；

一次性注射器（0.5-2mL）；

微孔滤膜（0.45μm）；

1.2.2 祛风止痛丸

乙腈：色谱纯；

甲醇：色谱纯；

正丁醇：分析纯；

氨水：优级纯；

川续断皂苷Ⅵ（标准品）：(98.0%）；

1.3 测试条件

1.3.1 返魂草

色谱柱：C18 5μm, 4.6×250mm；

柱温：35℃；

流速：1mL/min；

检测波长：350nm；

进样方式及进样量：自动部分10μL进样；

流动相：A：乙腈 B：0.2%甲醇溶液；

        表2. 返魂草流动相梯度洗脱条件

1.3.2 祛风止痛丸

色谱柱：C18 5μm, 4.6×250mm；

柱温：35℃；

流速：1mL/min；

检测波长：212nm；

进样方式及进样量：自动部分10μL进样；

流动相：乙腈-水=30:70；

1.4 溶液配制

1.4.1 返魂草

1.4.1.1 标准储备液

①精确量取标准品绿原酸（100μg/mL）600μl，加甲醇制成每1mL含绿原酸60μg的绿原酸标准储备液。

②精密称定标准品金丝桃苷（98.0%）0.0042g，用甲醇定容至100mL容量瓶中制成40μg/mL的金丝桃苷标准储备液。

1.4.1.2 混合标准工作液

分别量取绿原酸标准储备液、金丝桃苷标准储备液各500uL，混匀，即可配制成每1mL含绿原酸30μg、金丝桃苷20μg的混合标准工作液。

1.4.1.3 供试品溶液

取本品粉末（过四号筛）0.2506g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液20mL,密塞，称定重量，超声处理（250W，频率40KHz）60分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

1.4.2 祛风止痛丸

1.4.2.1 水饱和的正丁醇

在分液漏斗里面倒入适量的水和正丁醇，振摇提取数分钟，放置分层后，先将下层的水（水的密度较正丁醇大）从漏斗中缓慢放出，余下者即为水饱和正丁醇。

1.4.2.2 氨试液

取浓氨溶液60mL，加水使成150mL，即得。

1.4.2.3 正丁醇饱和的水

在水中加入足量的正丁醇，混合均匀，然后静置分层，取水使用。

1.4.2.4 标准品溶液

取川续断皂苷Ⅵ对照品0.0052g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即制成每1mL含0.2mg的溶液。

1.4.2.5 供试品溶液

取祛风止痛丸适量，研细，取1.9998g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL,密塞，称定重量，超声处理（250W，频率50KHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加水25mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次（50mL，30mL,30mL），合并正丁醇提取液，用氨试液100mL洗涤，再用正丁醇饱和的水100mL洗涤，取正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至25mL用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

2 结果与讨论

2.1 绿原酸、金丝桃苷标准品检测

         图1. 绿原酸、金丝桃苷标准品色谱图

           表3. 绿原酸标准品色谱参数

          表4. 金丝桃苷标准品色谱参数

2.2返魂草样品检测

               图2 返魂草色谱图

           表5. 返魂草绿原酸色谱参数

           表6. 返魂草金丝桃苷色谱参数

说明：据返魂草色谱图可见样品绿原酸、金丝桃苷分离效果、重复性较好，根据外标法计算返魂草中含绿原酸（C16H18O9）为0.25%，含金丝桃苷（C21H20O12）为0.127%。

2.3川续断皂苷Ⅵ标准品检测

         图3. 川续断皂苷Ⅵ标准品色谱图

  表7. 川续断皂苷Ⅵ标准品色谱参数2.4祛风止痛丸样品检测

            图4. 祛风止痛丸色谱图

            表8. 祛风止痛丸色谱参数

说明：据色谱图可见祛风止痛丸样品、川续断皂苷标准品的重复性较好，根据外标法计算，以川续断皂苷Ⅵ（C47H76O18）计，祛风止痛丸中每1g含续断6.35mg。

3 结论

据吉林省中药材标准DBY-22-JLYC-001-2017，返魂草样品含量测定按干燥品计算，含绿原酸（C16H18O9）不得少于0.10%，金丝桃苷（C21H20O12）不得少于0.050%。使用皖仪科技高效液相色谱仪LC3200系列配置紫外-可见光检测器测得返魂草样品中含绿原酸（C16H18O9）为0.25%，含金丝桃苷（C21H20O12）为0.127%，返魂草样品中绿原酸（C16H18O9）的定性RSD（%）为0.355%，定量RSD（%）为0.491%。样品中金丝桃苷（C21H20O12）的定性RSD（%）为0.399%，定量RSD（%）为0.403%，均符合标准。

据《中国药典》，祛风止痛丸样品含量测定按每1g含续断以川续断皂苷VI（C47H76O18）计，不得少于4.30mg。使用皖仪科技高效液相色谱仪LC3200系列配置紫外-可见光检测器测得祛风止痛丸样品中以川续断皂苷Ⅵ（C47H76O18）计每1g含续断6.35mg，祛风止痛丸样品中川续断皂苷VI（C47H76O18）的定性RSD（%）为0.331%，定量RSD（%）为0.663%，符合标准。

实验结果表明，使用皖仪科技高效液相色谱仪LC3200系列配置紫外-可见光检测器测定返魂草和祛风止痛丸中有效成分含量，分离效果和重复性较好，能够很好地满足《中国药典》和吉林省中药材标准DBY-22-JLYC-001-2017的测试要求。