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猪圆环病毒 2 型(PCV-2)核酸检测试剂盒

时间:2024-12-09      阅读:98

【产品名称】

通用名称: 猪圆环病毒 2 型(PCV-2)核酸检测试剂盒(PCR 法)

Name :Porcine Circovirus type II Detection Kit (PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

猪圆环病是由猪圆环病毒(Porcine Circovirus)引起猪的一种传染性、先天性颤抖和断奶仔猪多系统功能障碍性疾病。该病毒具有 PCV1 和PCV2 两种血清型, PCV1 无致病性。PCV2 具有很强的免疫抑制作用,临床上常表现为多病原混合感染,PCV2 与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)密切相关,还可引起猪皮炎与肾炎综合征、呼吸道综合征和 A2 型先天性震颤等疾病,给养猪业造成巨大经济损失。因此PCV2 感染早期诊断尤为重要。

本试剂盒适用于检测从肺、淋巴结组织、全血等标本中分离出的猪圆环病毒 2 型 DNA,用于猪圆环病毒 2 型的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒用一对猪圆环病毒 2 型特异性引物,对猪圆环病毒 2 型 DNA 进行体外扩增检测,用于科研实验中对可疑感染者的病原学检测。

【试剂组成】

PCV-2 反应液550μL×2 管

PCV-2 阳性质控品50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管

注:

1)不同批号试剂不能混用。

2)试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。


4.PCR 扩增(核酸扩增区)

4.1将待检测反应管置于 PCR 仪反应槽内;

4.2推荐循环参数设置:

步骤循环数温度时间

11 cycle94℃2min

2

35 cycles94℃30sec

58℃30sec

72℃60 sec

反应体系为 25μL;

5.电泳检测

1)2%琼脂糖凝胶配制:稀释 50×TAE 缓冲液至 1×TAE (取 20mL 50×TAE 缓冲液, 加 980mL 双蒸水至 1L),称 4g 琼脂糖放于 500mL 锥形瓶中,1×TAE 缓冲液 200 mL,置入微波炉中加热熔解(避免加热沸腾溶液外溢),再加入 10μL 染料充分混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后使用;

2)电泳:在电泳槽中加入 1×TAE 缓冲液,使液面刚刚没过凝胶。用移液器取 10μ L PCR 扩增产物于琼脂糖凝胶孔中。加样后,以 5V/cm 电压,电泳 20-30min(每次电泳时,每隔 10min 观察一次。当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下 2/5 处时,可停止电泳)。电泳后,紫外灯下观察结果。

6.结果判定

阳性质控品出现 1154 bp 条带,阴性质控品不出现条带或只出现片段较小的引物二聚体条带,实验结果成立。被检样品出现 1154 bp 条带,判断为阳性,否则为阴性。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融不超过 5 次,有效期 12 个月。

【所需仪器】

PCR 仪、电泳仪、紫外凝胶成像仪等

【标本采集】

病死或扑杀的猪,取肺、淋巴结等组织;待检活猪,用注射器取血 5mL

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标

本运送应采用 2~8℃冰袋运输,严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理(样本处理区)

1.1样本前处理

组织样品:每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中; 全血样本:待血凝固后,取血清放于离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清 100 μL 于灭菌离心管中

1.2DNA 提取

采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的 DNA 提取试剂盒(离心柱提取法),请

按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制(试剂准备区)

根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:

试剂PCV-2 反应液

用量(样本数为 N)21μL

3.加样(样本处理区)

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。

4.PCR 扩增(核酸扩增区)

4.1将待检测反应管置于 PCR 仪反应槽内;

4.2推荐循环参数设置:

步骤循环数温度时间

11 cycle94℃2min

2

35 cycles94℃30sec

58℃30sec

72℃60 sec

反应体系为 25μL;

5.电泳检测

1)2%琼脂糖凝胶配制:稀释 50×TAE 缓冲液至 1×TAE (取 20mL 50×TAE 缓冲液, 加 980mL 双蒸水至 1L),称 4g 琼脂糖放于 500mL 锥形瓶中,1×TAE 缓冲液 200 mL,置入微波炉中加热熔解(避免加热沸腾溶液外溢),再加入 10μL 染料充分混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后使用;

2)电泳:在电泳槽中加入 1×TAE 缓冲液,使液面刚刚没过凝胶。用移液器取 10μ L PCR 扩增产物于琼脂糖凝胶孔中。加样后,以 5V/cm 电压,电泳 20-30min(每次电泳时,每隔 10min 观察一次。当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下 2/5 处时,可停止电泳)。电泳后,紫外灯下观察结果。

6.结果判定

阳性质控品出现 1154 bp 条带,阴性质控品不出现条带或只出现片段较小的引物二聚体条带,实验结果成立。被检样品出现 1154 bp 条带,判断为阳性,否则为阴性。

7.产品性能指标

试剂灵敏性 10-3 以上,特异性 100%,批间批内差异≤3%。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行;

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完-全混匀并短暂离心;

3.反应液应避光保存;

4.反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全   通则》进行处理。

【参考文献】

[1]许立华, 芦银华等. 猪圆环病毒研究进展[J]. 中国病毒学, 2004, 19(3): 288-290.

[2]杨汉春. 猪免疫抑制性疾病的流行特点与控制对策[J].中国畜牧兽医, 2004.

[3]Wellenberg G, Pesch S, Berndsen F. Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of postweaning multi- systemic wasting syndrome in Netherlands [J]. Veterinary Quarterly, 2000, 22(3): 167-172.


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