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猪圆环病毒 3 型(PCV-3)核酸检测试剂盒

时间:2024-12-09      阅读:94

猪圆环病毒 3 型(PCV-3)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

【产品名称】

通用名称:猪圆环病毒 3 型(PCV-3)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

Name :Porcine Circovirus type Ⅲ Detection Kit(Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

猪圆环病毒(Porcine circoviruses,PCV)是单股环状的 DNA 病毒,基因组长度约为 1.7kb 长,是最小的动物 DNA 病毒之一。已经确定有两种类型的 PCV,即圆环病毒 1 型(PCV1)和圆环病毒 2 型(PCV2)。2015-2016年间,一种新型的圆环病毒 3 型病毒首先在美国报道,该病毒基因组长为 2.0kb,其能引起猪的皮炎肾病终合症、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应,对猪场疾病控制十分重要。

本试剂盒适用于检测肺、淋巴结组织、全血等样本中的猪圆环病毒 3 型,用于猪圆环病毒 3 型感染的辅助诊

断。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术,设计一对猪圆环病毒 3 型特异性引物,结合一条特异性探针,用荧光 PCR 技术对猪圆环病毒 3 型的核酸进行体外扩增检测,用于科研实验中对可疑感染者的病原学检测。

【试剂组成】

包装规格50T/盒

PCV-3 反应液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

PCV-3 阳性质控品50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管

说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀的猪,取肺、淋巴结等组织;待检活猪,用注射器取血 5mL。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输, 严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理(样本处理区)

1.1样本前处理

组织样品:每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL灭菌离心管中;全血样本:待血凝固后,取血清 100μL 于灭菌离心管中。

1.2核酸提取

推荐采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提取,请按照    试剂说明书进行操作。

2.试剂配制(试剂准备区)

根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:

试剂PCV-3 反应液酶液

用量(样本数为 N)20μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21μL/管。

3.加样(样本处理区)

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。

4.PCR 扩增(核酸扩增区)

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;

4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;

荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择

ROX 参比荧光,选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置:

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle95℃10min

240 cycles94℃15sec

55℃30sec

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。

5.2结果判断

阳性:检测通道 Ct 值≤35.0,且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑:检测通道 Ct 值>35.0,且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验,重复试验结果出现 Ct 值≤35.0 和典型扩增曲线者为阳性,否则为阴性。

阴性:样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。

6.质控标准

阴性质控品:无明显扩增曲线且无 Ct 值显示;

阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。

7.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;

3.阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;

4.病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;

5.不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;

6.试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;

7.本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行;

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完-全混匀并短暂离心;

3.反应液应避光保存;

4.反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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