产品名称：碧云天beyotime免疫沉淀试剂盒(Protein A+G磁珠法)(P2179S)现货供应

产品货号：P2179S

产品品牌：碧云天beyotime

使用方法：

1.试剂盒的准备。

a.参考下表，按照每个样品使用100-500μl裂解液的比例，准备相关试剂。

b.含抑制剂裂解液的配制。参考上表，按照每50-100万细胞使用100-200μl含抑制剂裂解液用于裂解以及300-600μl含抑制剂裂解液用于洗涤的比例，配制适量的含抑制剂裂解液。将Lysis Buffer与Protease Inhibitor Cocktail (100X)按照100:1的比例混合，例如在1ml的Lysis Buffer中加入10μl Protease Inhibitor Cocktail (100X)，即得1ml含抑制剂裂解液(Lysis Buffer with Protease Inhibitor Cocktail)。配制好的含抑制剂裂解液宜放置在冰浴或4℃。

注1：如果免疫沉淀的目的蛋白涉及磷酸化修饰或者乙酰化修饰，需要添加磷酸酶抑制剂或去乙酰化酶抑制剂。推荐使用碧云天的磷酸酶抑制剂混合物A (50X) (P1081/P1082)和去乙酰化酶抑制剂混合物(100X) (P1112/P1113)。如果有特殊需求，可考虑选择其它适当的抑制剂混合物。

注2：本试剂盒提供的Lysis Buffer不仅用于样品裂解，也用于后续的洗涤步骤，请特别注意“注意事项”中的相关描述。

注3：含抑制剂裂解液宜现用现配，不宜配制后冻存并留作后续使用。如果有特殊需求，可以尝试碧云天的其它多种蛋白酶、磷酸酶和去乙酰化酶抑制剂混合物。

c.TBS的配制。将TBS (10X)用超纯水水稀释至1X，即为TBS。例如1ml TBS (10X)加入9ml超纯水，混匀后即为TBS。

d.磁珠的准备。由于磁珠储存在特殊保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。

(a)用移液器轻轻吹打重悬磁珠，按照每500μl样品使用20μl磁珠悬浊液比例，取适量磁珠至一洁净离心管中(FTUB015)，加入TBS至最终体积为约0.5ml。说明：如果初始磁珠体积大于0.2ml，可以考虑先直接置于磁力架上分离10秒，去除上清，然后再加入TBS至最终体积为约0.5ml。

(b)用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复上述步骤两次。

(c)按照初始体积的量，用TBS重悬磁珠。

e.SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)的配制。取适量SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)用水稀释5倍即为SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)。例如0.2ml SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)加入0.8ml超纯水，混匀后即为SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)。

2.细胞或组织样品的裂解和准备。样品裂解后宜立即进行后续的免疫沉淀或免疫共沉淀，如果不能立即进行后续的实验，可以-20℃或-80℃冻存，但冻融可能会影响蛋白与蛋白的相互作用。所有的样品裂解步骤宜在冰浴或4℃操作，以尽量减少蛋白降解的可能性。样品准备好后，注意取一定量作为Input或Total，以用于后续的Western等检测。

a.悬浮细胞的样品裂解和准备。250-1000×g室温离心5min收集细胞。如有必要，可以使用PBS洗涤一次，然后吸净残留的液体。轻轻vortex或者弹击管底以把细胞尽量分散开。按照每50-100万细胞加入100-200μl的比例加入含抑制剂裂解液。轻弹管底或适当吹打，以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，建议分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。充分裂解后，10,000-14,000×g在4℃离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的免疫沉淀和免疫共沉淀等。注：裂解后会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。

b.贴壁细胞样品的裂解和准备。吸除培养液。如有必要，用PBS洗涤一次，然后吸净残留的液体。按照每50-100万细胞(相当于6孔板的一个孔)加入100-200μl的含抑制剂裂解液，适当吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。植物细胞宜在冰上裂解2-10min。充分裂解后，10,000-14,000×g在4℃离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的免疫沉淀和免疫共沉淀等。注：裂解后会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。

c.细菌或酵母样品的裂解和准备。对于1ml菌液或酵母液，离心去上清，如果有必要，可以使用PBS洗涤一次，然后吸净残留的液体。轻轻vortex或者弹击管底以

把细菌或酵母尽量分散开。加入100-200μl含抑制剂裂解液，轻轻vortex或者弹击管底以混匀，冰上裂解2-10min。如果希望获得更好的裂解效果，细菌和酵母可以分别使用溶菌酶(lysozyme)和破壁酶(lyticase)消化，然后再使用含抑制剂裂解液进行裂解。充分裂解后，10,000-14,000×g在4℃离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的免疫沉淀和免疫共沉淀等。注：裂解后很可能会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。

d.组织样品的裂解和准备。

(a)把组织剪切成细小的碎片。如果组织样品本身非常细小，也可以不再进行剪切。

(b)按照每10-20毫克组织使用100-200μl的比例加入含抑制剂裂解液。如果裂解不充分可以使用更多的含抑制剂裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

(c)用玻璃匀浆器匀浆，或使用碧云天生产的E6600 TissueMaster™手持式组织研磨仪研磨，直至充分裂解。也可以把组织样品冷冻后液氮研磨，研磨充分后加入裂解与洗涤液进行裂解。

(d)充分裂解后，10,000-14,000×g在4℃离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的免疫沉淀和免疫共沉淀等。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200μl含抑制剂裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15-25mg/ml，不同状态的不同组织有所不同。注：裂解后很可能会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。

3.抗体与Protein A+G磁珠的结合。

a.抗体的准备。按抗体使用说明中推荐的稀释比例用TBS稀释抗体，配制成抗体工作液；或将抗体配制成终浓度5-50μg/ml的抗体工作液。置于冰上备用。可选做：使用抗体种属相同的正常IgG配制相同稀释比或终浓度的正常IgG工作液，以用于去除非特异性结合或作为阴性对照。所谓种属相同的正常IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的抗体是小鼠IgG，则在本步骤中可以用TBS稀释适量的Normal Mouse IgG等以用于降低背景或作为阴性对照。

b.抗体吸附。将步骤1d准备好的Protein A+G磁珠进行磁性分离，吸除上清，加入500μl抗体工作液或正常IgG工作液，重悬后在室温翻转混合仪上翻转孵育15分钟-1小时。注：也可以直接在步骤1d的Protein A+G磁珠中加入适量抗体或正常IgG进行孵育。

c.洗涤。加入500μl的TBS，用移液器轻轻吹打重悬Protein A+G磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复洗涤三次。按照初始体积的量，用TBS重悬Protein A+G磁珠。注：孵育和洗涤过程中，如果磁珠发生聚团或呈片状属正常现象，不会影响实验结果。

4.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)。

a.去除非特异性结合(可选做)。步骤3中准备的结合了正常IgG的Protein A+G磁珠与样品4℃孵育1小时后磁性分离，上清样品用于后续实验。本实验步骤的目的是去除与正常IgG产生非特异性结合的蛋白。

b.样品与结合了抗体或正常IgG的Protein A+G磁珠孵育。按照每500μl蛋白样品加入20μl磁珠悬浊液的比例加入结合了抗体或正常IgG的Protein A+G磁珠，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育2小时或4℃孵育过夜。

注1：孵育过程中，如果磁珠发生聚团或呈片状属正常现象，不会影响实验结果。

注2：也可先将适量抗体或正常IgG与样品室温孵育1-2小时或4℃孵育过夜后，再加入10-20μl磁珠悬浊液室温孵育1小时。具体见常见问题2。

c.磁分离。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测免疫沉淀的效果。

d.洗涤。加入0.5ml的含抑制剂裂解液，用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复使用含抑制剂裂解液洗涤三次。注：也可以通过检测洗涤得到的液体的OD280来判断是否洗涤完成，若OD280大于0.05，应适当增加洗涤次数。

5.洗脱。根据标签蛋白的特点及后续实验要求，可以选择如下3种方法之一进行洗脱。

a.酸性洗脱法。本方法为非变性法，比较快速高效。洗脱后的蛋白很多情况下能保持原有的生物活性，便于后续分析检测。

(a)每20μl原始磁珠体积，加入100μl Acid Elution Buffer (酸性洗脱液)，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育5分钟。注：孵育时间不宜超过15分钟。

(b)孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中，并立刻加入10μl Neutralization Buffer (中和液)，适当混匀。注：须立刻加入中和液并混匀，否则长时间处于酸性洗脱液中会容易导致一些蛋白失去活性。

(c)为了获得最大的洗脱效率，可重复步骤(a)和(b)，并将相同样品合并。

(d)洗脱并中和的Flag标签蛋白及其复合物置于4℃待用，或者-20℃或-80℃长期保存。

相关文献：

[1] Yujuan Zhan, Qiugu Chen, Yue Song, Xianli Wei, Tingxiu Zhao, Bonan Chen, Chengxi Li, Wenbo Zhang, Yanjun Jiang, Yuhui Tan, Biaoyan Du, Jianyong Xiao, Kun Wang.Berbamine Hydrochloride inhibits lysosomal acidification by activating Nox2 to potentiate chemotherapy-induced apoptosis via the ROS-MAPK pathway in human lung carcinoma cells

Cell Biol Toxicol. 2023 Aug;39(4):1297-1317. doi: 10.1007/s10565-022-09756-8. (IF 6.284)

[2] Linhong Liao, Hui Cheng, Shusong Liu.Non-SMC condensin I complex subunit H promotes the malignant progression and cisplatin resistance of breast cancer MCF-7 cells Oncol Lett. 2022 Jul 19;24(3):317. doi: 10.3892/ol.2022.13438. (IF 2.311)

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