产品名称：碧云天beyotime线粒体膜电位与细胞凋亡检测试剂盒(C1071M)现货供应

产品货号：C1071M

产品品牌：碧云天beyotime

使用方法：

1. 对于悬浮细胞：

a. 在进行完细胞凋亡刺激后，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。

b. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入188μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。

c. 加入2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色液、5μl Annexin V-FITC和5μl Hoechst 33342染色液，轻轻混匀。注意：Hoechst 33342染色液可以选择性加入，不加入也是可以的。

d. 室温(20-25℃)避光孵育20-30分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。

e. 如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测，Mito-Tracker Red CMXRos为红色荧光(Ex/Em:579/599nm)，Annexin V-FITC为绿色荧光(Ex/Em:492/520nm)，Hoechst 33342为蓝色荧光(Ex/Em:350/461nm)，很多时候流式检测仅检测红色和绿色荧光即可，也可以同时检测红绿蓝三色荧光。如果用于荧光显微镜检测，1000g离心5分钟，收集细胞，用50-100μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。

注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内完成检测；荧光探针的浓度可以根据具体的染色效果进行适当调整，以获得更好的染色效果；荧光显微镜检测或流式细胞仪检测时，都可以不加入Hoechst 33342染色液。

2. 对于贴壁细胞的消化后检测：

a. 把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。

注意：对于贴壁细胞，胰酶消化步骤很关键。胰酶消化时间如果过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤；消化时间如果过长，同样易造成细胞膜损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合从而干扰对于细胞凋亡的检测。同时，胰酶细胞消化液中应尽量不含EDTA，因为EDTA可能会影响Annexin V与磷脂酰丝氨酸的结合。

b. 加入步骤2a中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。注意：加入步骤2a中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-FITC导致染色失败。

c. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入188μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。

d. 加入2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色液、5μl Annexin V-FITC和5μl Hoechst 33342染色液，轻轻混匀。注意：Hoechst 33342染色液可以选择性加入，不加入也是可以的。

e. 室温(20-25℃)避光孵育20-30分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。

f. 如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测，Mito-Tracker Red CMXRos为红色荧光(Ex/Em:579/599nm)，Annexin V-FITC为绿色荧光(Ex/Em:492/520nm)，Hoechst 33342为蓝色荧光(Ex/Em:350/461nm)，很多时候流式检测仅检测红色和绿色荧光即可，也可以同时检测红绿蓝三色荧光。如果用于荧光显微镜检测，1000g离心5分钟，收集细胞，用50-100μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。

注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内完成检测；荧光探针的浓度可以根据具体的染色效果进行适当调整，以获得更好的染色效果；荧光显微镜检测或流式细胞仪检测时，都可以不加入Hoechst 33342染色液。

3. 对于贴壁细胞的原位荧光检测：

注：本方法的优点是可以原位观察细胞凋亡，缺点是部分凋亡由于不贴壁而检测不到。

a. (选做)如果条件许可，把细胞培养于24孔板、48孔板或96孔板内。在凋亡诱导结束后，用可以对多孔板进行离心的离心机1000g离心5分钟。

b. 吸除细胞培养液，加入PBS洗涤一次。

c. 加入188µl Annexin V-FITC结合液。

d. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀。

e. 加入2µl Mito-Tracker Red CMXRos染色液和5μl Hoechst 33342染色液，轻轻混匀。注意：Hoechst 33342染色液可以选择性加入，不加入也是可以的。

f. 室温(20-25℃)避光孵育20-30分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。

g. 随即在荧光显微镜下观察，Mito-Tracker Red CMXRos为红色荧光，Annexin V-FITC为绿色荧光，Hoechst 33342为蓝色荧光。

注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内完成检测。荧光显微镜检测时，也可以不加入Hoechst 33342染色液。

相关文献：

[1]Tingting Liu, Cheng Jiang, Liying Zhu, Ling Jiang, He Huang. Fe 3 O 4@chitosan Microspheres Coating as Cytoprotective Exoskeletons for the Enhanced Production of Butyric Acid With Clostridium tyrobutyricum Under Acid Stress Front Bioeng Biotechnol. 2020 May 15;8:449. doi: 10.3389/fbioe.2020.00449.

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