（1）标准的PCR反应条件：

10X缓冲液：10 μL

4种dNTP混合物：各200umol/L

引物：各10～100pmol

模板DNA：0.1～2μg

Taq DNA聚合酶：2.5U

Mg2+ ：1.5mmol/L

（2）PCR反应过程：

（3）PCR反应特点：

灵敏度高

皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平

能从100万个细胞中检出一个靶细胞

病毒检测的灵敏度可达3个RFU

细菌检测的最小检出率为3个细菌

简便、快速

一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增

扩增产物一般用电泳分析

对标本的纯度要求低

血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA

PCR反应体系

以DNA为模板的反应

反应体积：50~100μl

缓冲液

引物

底物：4种dNTP

模板：102~105拷贝

TaqDNA聚合酶

矿物油

以mRNA为模板的反应（逆转录PCR）

逆转录反应体系

体积：20 μl

缓冲液

底物：4种dNTP

引物：oligo(dT)12~18

模板：RNA

逆转录酶

其他试剂：RNA酶抑制剂，

MgCl2.DTT.牛血清白蛋白

PCR反应体系同以DNA模板的反应体系

（一）PCR反应成分

1、模板

  单、双链DNA均可。

  不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。

  一般100ng DNA模板/100mL。

  模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。

2、引物浓度

    0.1-0.5 mmol/L

    浓度过低影响产量，偏高引起错配和非特异性产物增加，且可增加引物二聚体的产生几率。

3、Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)

    0.5-2.5 U/50 ml

    酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。

4、dNTP  20~200μmol/L

      dNTP浓度取决于扩增片段的长度

      四种dNTP浓度应相等

     浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量，但特异性增加

     dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。

5、 Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。

0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。

Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。

Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。

6、 PCR反应的缓冲液

10~50mmol/L Tris-Cl 缓冲液，72℃ 时pH 7.2,调节反应体系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50 mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。

（二）循环参数

1、变性  

    94oC~95oC，30-60 s

   且最初在加Taq酶之前先于97oC充分变性5~10min

2、退火  

    50oC~55oC，60-90 s

    增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;

    降低温度可增加反应的灵敏性。

3、延伸

      70oC~74oC，60-120 s

      延伸时间由扩增片段长度决定

4、循环次数

     主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次

    次数过多：非特异扩增增加

（三）PCR产物的积累规律

在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。

多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。

PCR产物的积累规律示意图