五、PCR引物的设计

（一）一般原则

1、引物长度在15～30碱基。引物过短，会使特异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合成引物的成本增加。

2、引物中碱基的分布是随机的，避免4个以上的嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在

  45～55％左右。

3、避免两引物间的互补，特别是3‘端互补，以免形成二聚体。

4、引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变性。

5、引物的3’端不能有任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。

6、引物的5’端限定着PCR产物的长度，可根据产物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法。

7、引物与非扩增序列的同源性不应超过70％。

（二）引物设计的方法

1、直接提交模板序列到特定网页。

2、引物设计软件。功能：首先是引物分析评价功能，其中以“Oligo 6”为优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同。

六、PCR产物的检测

（一）琼脂糖凝胶电泳

是PCR扩增产物的分离、纯化和鉴定常用的方法。其分辨率很高，可测出1ng DNA。一般800bp以上的片段用0.8%的胶，800bp以下的片段用1.0%～2.0%的胶。

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳

灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高，主要用于分离制备小于1kb长度的低分子质量基因片段，因此特别适用于合成的基因片段的分离和检测。适用于PCR扩增效率低时产物的检测。根据扩增片段的大小选择合适的胶浓度，电泳后可用银染或溴乙锭染色检测，银染比EB染色检测灵敏度高2～10倍。

（三）层析技术

高效液相色谱(HPLC)是在常压基础上发展起来的一项现代化分析技术，其特点是分离速度快、效果好，是目前基因片段分离纯化所广泛采用的方法之一。

离子交换层析（ IEC ）的基础是溶质分子所携带的电荷，而合成的基因片段恰好具有这一性质。因此，IEC分析广泛应用于DNA的合成及其扩增后的分离纯化。

（四）分子杂交

为了确定PCR产物是否是预先设计的目的片段，或产物是否有突变，都需做分子杂交检测。分子杂交包括点杂交和Southern印迹杂交。点杂交灵敏度较高，特别适用于特异性不高的PCR扩增产物分析。

 Southern印迹杂交可鉴定PCR产物的大小和特异性，检测灵敏度可达10ng。基本过程是PCR产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳，然后，印迹转移到尼龙膜上，再用标记的探针进行杂交检测。

（五）限制性内切酶酶切分析

若知道PCR扩增片段的序列或限制性内切酶酶切图谱，则可选择合适的限制酶消化PCR产物，再进行电泳分析，根据PCR酶切产物的电泳图谱，可判定PCR产物的特异性及是否存在突变。

（六）PCR扩增产物的直接测序

直接序列分析是指在PCR扩增基因组DNA序列的基础上，直接进行基因核苷酸序列分析的方法，是检测基因突变有效、直接的方法。

七、PCR中应注意的事项

（一）防止污染

试剂小量分装

吸头及Ep管一次性使用

器皿及工作区域要分开，无菌操作

（二）设立对照：

阳性对照：阳性模板

阴性对照：阴性模板

试剂对照：除模板外的所有组分