大肠杆菌折戟沉沙，谁来拯救包涵体蛋白？
时间：2024-07-16 阅读：116
哈喽宝子们，我最近遇到了一个难缠的蛋白，用大肠杆菌表达后会出现在沉淀中。如果从沉淀中提取纯化，操作复杂姑且不论，还有可能没有活性！如果优化培养条件让它在上清中表达，需要慢慢摸索，费时费力还不一定成功。这几天为了思考解决办法，真是要茶饭不思了！
闭门造车不如出门取经，这不，我在万能的师兄这里求来了一样新“法宝”，据说它可以让包涵体蛋白在上清中表达。今天让我们一起来看一下它究竟“威能”如何吧！内含我的真实实验步骤+结果+操作Tips哦。
如何拯救包涵体蛋白？
“法宝”显威——无细胞蛋白表达试剂盒初体验
一、使用前准备
打开试剂盒，让我们看一下它的庐山真面目。
试剂盒内一共三个组分，分别是：
组分A、组分B、PC（阳性对照质粒）。
将各组分取出，在冰上融化。
二、模板准备
与原核细胞表达不同，这款无细胞试剂盒可以不用质粒模板，只需要在目的基因上下游引入T7转录表达原件，构建一个线性模板。
第一步，用PCR分别获得5UTR片段，3UTR片段以及目的基因片段；
第二步，用重叠PCR方法，将上一步获得的目的基因片段和5UTR片段，3UTR片段拼接称完整的线性表达模板。
三、体系构建
由于是初次尝试，我这次选择50μL的总体积。在96孔板中反应，按照这张表加试剂和构建好的DNA模板5μL（体系体积的1/10），用移液枪反复吹打混匀。
试剂 | 阴性对照（μL） | 阳性对照（μL） | 实验组（μL） |
组分A | 20.5 | 20.5 | 20.5 |
组分B | 16.7 | 16.7 | 16.7 |
DNA模板 | / | 5 | 5 |
双蒸水 | 12.8 | 7.8 | 7.8 |
反应总体积 | 50 | 50 | 50 |
四、孵育
将混合好的反应液转移至摇床中，温度25℃、180rpm，反应16h，确保蛋白表达。
孵育四小时后，迫不及待先看一下GFP的表达情况，观察到阳性对照已有明显绿色荧光。
五、收获
次日一早，打开摇床就看到了阳性对照醒目的绿色荧光。既然阳性对照表达了，目标蛋白想来不成问题！满怀期待开始离心、跑胶鉴定。
六、鉴定
将阴性对照和实验组分别制洗脱样、上清样、沉淀样，上样量：洗脱样、上清样10μL，沉淀样5μL。电泳条件：12%SDS-PAGE胶，100V，1.5h。
不愧是师兄力荐的“法宝”，没有辜负我的厚望，第一次实验，我的蛋白就在上清中成功表达了！
七、总结
这次实验真是一次全新的体验。在无细胞蛋白表达体系下，整个实验从模板构建、反应体系构建、孵育、到最后收获目标蛋白并鉴定，只用了两天时间，不但在上清中表达出了原核细胞表达中会形成包涵体的蛋白，还大大缩短了实验时间。真让我有把所有蛋白都用无细胞体系表达的冲动！
1.无细胞蛋白表达试剂盒可以用线性模板也可以用质粒模板，线性模板更加方便快捷，但是质粒模板表达量一般较高。
2.组分A、B在实验前要提前放在冰上融化，防止试剂失效。使用前先用移液枪吹打混匀，再吸取相应体积。
3.微孔板四周可以加入适量双蒸水，防止孵育过程中体系水分蒸发。本次实验因为要过夜表达，为了确保反应体系不被蒸干，我在96孔板最外侧一周的所有孔位里都加了水，而且在摇床四角也各放置了一只装水的离心管。
4.对于复杂蛋白表达，可以延长孵育时间，保证蛋白充分表达。
5.如果调整反应体积，需要按照说明书推荐随之调整反应容器。
CFPS——蛋白表达“新势力”
初次表达包涵体大获成功，无细胞蛋白表达究竟是“何方神圣”？在实验结束之后，我粗略了解了一下这一新技术，发现它的强大不止于此。
无细胞蛋白表达（Cell-free protein expression，CFPS）是指将细胞内合成蛋白所需要的RNA聚合酶、核糖体及转录翻译辅助因子等分子机器提取出来，并辅以核苷酸、氨基酸、能量物质及基因模板，在没有活细胞参与的体外直接合成蛋白质的生物合成反应。
受细胞自身生理功能限制，有些蛋白在传统的细胞表达系统产量低甚至不能表达，而无细胞系统可以摆脱这种限制，广泛适用于细胞因子、抗体、膜蛋白、毒性蛋白、包涵体蛋白表达等场景。此外，无细胞蛋白表达反应周期短、易与自动化设备结合、自由度与可控程度高，适合蛋白快速交付、酶定向进化筛选、AI蛋白制造、ADC药物开发等领域，可谓是蛋白表达领域的“新势力”。
随着合成生物学发展，无细胞蛋白表达技术已然崭露头角，大有腾飞之势。技术的发展是推动科学研究进步的重要助力，善于利用新技术，有时能使科研过程事半功倍，我也算是深有体会了！