参考清华大学卢元教授的文章

《无细胞体系非天然蛋白质合成研究进展》

为什么用cell-free系统（CFUPS）

非天然氨基酸表达难点：

（1）目标蛋白合成途径非细胞内主反应，导致产物产量较低，纯化步骤繁琐；

（2）某些UNAAs不易穿过细胞膜屏障进入细胞，从而降低了细胞对UNAAs的利用率，限制UNAAs嵌入效率；

（3）非天然氨基酸的细胞毒性；

这些导致体内UNAAs的嵌入效率较低，特别是在多位点UNAAs嵌入时尤为明显。

无细胞蛋白合成系统（Cell-free protein synthesis, CFS）是一种在没有活细胞的情况下，利用细胞提取物进行蛋白质合成的技术。这种技术允许科学家在体外环境中合成蛋白质，而无需依赖细胞的内部机制。随着技术的发展，无细胞非天然蛋白质合成系统（CFUPS）进一步扩展了这一概念，允许合成含有非天然氨基酸（UNAAs）的蛋白质。

在CFUPS中，使用外源DNA或mRNA作为模板，这些模板编码的蛋白质序列包含非天然氨基酸。然后，将底物、能量物质、辅因子和非天然组分添加到反应体系中。这些非天然组分包括正交氨酰tRNA合成酶/正交tRNA（o-aaRS/o-tRNA）对，它们是专门设计的酶和tRNA，能够识别并结合非天然氨基酸。在细胞提取物提供的多种酶的作用下，这些非天然氨基酸被整合到蛋白质链中，从而合成出含有非天然氨基酸的蛋白质。

CFUPS与细胞非天然蛋白质合成相比具有诸多的优点

2. 怎么做：无细胞体系UNAAs嵌入的方法

    在无细胞非天然蛋白质合成系统（CFUPS）中，嵌入非天然氨基酸（UNAAs）的方法是实现非天然蛋白质合成的关键。以下是一些主要的嵌入方法，它们在CFUPS中被广泛使用：

（1）全局抑制：这种方法通过使用突变的释放因子（release factors）或tRNAs来抑制正常的终止密码子，使得翻译过程在遇到终止密码子时不会停止，而是继续添加非天然氨基酸。

（2）终止密码子抑制：这种方法利用特定的突变释放因子，它们能够识别终止密码子，但不会终止翻译过程，而是允许非天然氨基酸的插入。

（3）移码抑制：这种方法通过改变mRNA的读取框架来实现非天然氨基酸的嵌入。通过特定的策略，如使用特定的tRNAs或突变的tRNAs，可以在特定的位置插入非天然氨基酸，而不影响蛋白质的其余部分。

（4）有义密码子再分配：这种方法涉及将一个原本编码天然氨基酸的密码子重新分配给非天然氨基酸。这通常通过使用突变的tRNAs来实现，这些tRNAs能够识别特定的有义密码子，并将非天然氨基酸添加到蛋白质链中。

（5）非天然碱基对：这种方法通过扩展遗传密码来实现非天然氨基酸的嵌入。通过引入新的碱基对，可以编码更多的氨基酸，包括非天然氨基酸。这通常涉及到使用经过工程改造的聚合酶和tRNAs。

    这些方法的发展和应用，使得科学家能够在蛋白质合成过程中精确地控制非天然氨基酸的位置，从而为蛋白质工程和药物设计提供了新的工具。

3. 非天然氨基酸蛋白有什么用？

无细胞蛋白合成系统（CFUPS）在合成具有特定功能的非天然蛋白质方面取得了显著进展，并在多个领域展现出其重要性和应用潜力。以下是一些主要的应用领域：

（1）蛋白药物合成：CFUPS可以用于合成具有治疗潜力的蛋白质药物，包括抗体、酶和激素等。通过在蛋白质中嵌入非天然氨基酸，可以提高药物的稳定性、延长半衰期或增强其生物活性。

（2）病毒样颗粒（Virus-like particles, VLPs）：VLPs是模仿病毒结构的纳米级颗粒，但不含病毒遗传物质，因此不具有传染性。CFUPS可以用于合成VLPs，这些颗粒在疫苗开发和药物递送系统中具有应用潜力。

（3）膜蛋白合成：膜蛋白在细胞信号传导、物质转运和能量转换等过程中发挥关键作用。CFUPS可以用于合成具有特定功能的膜蛋白，这有助于研究其结构和功能，以及开发针对这些蛋白的药物。

（4）蛋白质材料：CFUPS可以用于合成具有特定物理或化学性质的蛋白质材料，这些材料可以用于组织工程、生物传感器或纳米技术等领域。

（5）蛋白质间相互作用研究：CFUPS提供了一种工具，用于研究蛋白质之间的相互作用，这对于理解细胞内信号传导途径和开发新的干预策略至关重要。

（6）开发新型蛋白材料：通过CFUPS合成的非天然蛋白质可以被设计成具有特定的结构和功能，用于开发新型的生物材料，这些材料可能具有的机械性能或生物相容性。

4. 后续开发方向

将来无细胞非天然蛋白质合成系统需要朝着4个方面发展，分别是：1)开发更有效的OTSs，提高非天然氨基酸的嵌入效率；2)实现在目标蛋白的多个位点嵌入多种UNAAs，扩大非天然蛋白质的种类；3)解决UNAAs多样性带来的生物不相容性，使非天然蛋白质的产量得到大幅度的上升；4)进一步降低非天然蛋白质合成的成本，使其能够带来可观的经济效益，促进工业化应用。最大限度去开发无细胞非天然蛋白质合成平台的潜力，使其能够更好地应用于科学基础研究及工业生产研究。

挑战（Challenges）

• UNAA嵌入位点的选择：选择合适的非天然氨基酸（UNAA）嵌入位点。

• 多位点UNAA嵌入：实现在蛋白质中多个位点嵌入UNAAs。

• 与内源元素的交叉反应：避免与细胞内源性成分的反应。

• UNAA嵌入效率低：提高UNAA嵌入的效率。

• 困难的核糖体工程：改进核糖体工程以适应非天然氨基酸的合成。

• 缺乏可扩展的系统：开发可大规模应用的CFUPS系统。

• 高成本：降低CFUPS系统的经济成本。

• 耗费时间和劳动力：减少制备、纯化和分析过程中的时间和劳动力消耗。

潜在改进（Potential improvements）

• 开发非天然蛋白质的蛋白质折叠预测算法：帮助预测UNAAs嵌入后蛋白质的折叠状态。

• 开发无需纯化的高通量筛选方法：简化筛选过程，提高效率。

• 筛选更多正交翻译对：增加可用于UNAA嵌入的正交氨酰tRNA合成酶/正交tRNA对。

• 加速开发移码抑制、有义密码子再分配和非天然碱基对方法：推动这些嵌入技术的发展。

• 进化正交翻译对：通过进化生物学方法改进正交翻译对的性能。

• 工程化底盘生物：通过基因工程改造底盘生物以适应CFUPS系统。

• 优化CFUPS系统的成分组成：调整反应体系以提高UNAA嵌入效率。

• 发展体外核糖体进化平台：用于改进核糖体以适应非天然氨基酸的合成。

• 模仿标准生物反应器配置：在大规模生产中应用CFUPS系统。

• 简化产品分析方法：减少分析过程中的复杂性。

• 自行合成试剂：包括UNAAs、tRNAs等，以降低成本。

• 优化能量供给系统：改进CFUPS系统中的能量供应。

• 优化细胞提取物、表达模板和OTS组分的制备：提高制备过程的效率和成本效益。

• 简化制备过程：减少制备过程中的时间和劳动力消耗。

• 简化纯化和分析过程：提高纯化和分析的效率。