酶定向进化的“加速器”—基于CFPS的高通量筛选方案（一）
时间：2024-10-11 阅读：203
酶是自然界重要的功能蛋白分子，其催化活性在基因编辑及干细胞技术、靶向药物的生产、食品工业、纺织工业、医学诊断、药物制备等领域都有着重要的作用。由于温度、pH、溶剂稳定性以及底物特异性和活性的限制，天然酶通常不是工业生产的较佳选择，定向进化是改善酶催化活性和热稳定性的常用方法。
基于细胞表达系统的突变体蛋白筛选流程包括构建突变基因库、构建载体、转化、挑取单克隆、扩大培养、裂解、纯化和活性测试等流程，操作繁琐、周期长、人力成本高昂。如果目的突变蛋白对宿主细胞有毒害作用，还可能导致表达失败。突变体蛋白筛选需要更高效的高通量筛选方案。
无细胞蛋白表达（CFPS）是一种没有活细胞参与的体外蛋白质生物合成技术，在高通量筛选场景具有优势：
①CFPS操作简单，可搭配高通量移液工作站，实现自动化操作。
②CFPS是开放的反应体系，可以根据特定蛋白质的调整pH、温度等反应条件，且允许在反应后上清液中直接检测突变蛋白功能，无需纯化。
③CFPS不受宿主细胞活力的限制，允许生产细胞毒性蛋白质。
④CFPS允许使用PCR产物作为模板，极大缩短模板制备流程。
PLD高通量筛选案例
本文展示了珀罗汀生物基于自主研发的CFPS系统建立的高通量酶筛选方案：
通过简并引物引入突变，建立突变文库，利用菌落分离单个突变基因，经过菌落PCR获得线性模板，线性模板直接用于CFPS反应，数小时后获得突变体酶，直接取上清检测酶活性。
利用该方案，我们在三天内完成了96个phi29 DNA聚合酶突变体的表达，并对其活性进行了检测，找到了较为高效的phi29 DNA聚合酶突变体。
突变引入及环化
我们选取了phi29DNA聚合酶的第221位和第350位氨基酸作为突变位点。先利用PCR的方式，将突变通过引物引入片段；再通过重叠PCR的方式整合突变片段。将整合好的目的基因片段和线性化的环状片段通过seamless酶进行连接，形成环化质粒。
在此过程中，每次以质粒为模板进行PCR之后，使用Dpn I 酶37℃消化1h以去除原始模板。
质粒转化并涂板
取5μL引入突变的质粒，加入到100μL DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上30min。随后将上述感受态细胞置于42°C水浴中，热激90秒后迅速放回冰浴中，静置3~5min；再将其加入到500 μL不含抗生素的SOC或LB培养液中，轻轻混匀，37°C震荡培养1h。通过离心菌液（5000 rpm，1min）沉淀菌体，再将大部分培养液移除，剩余约50~100μL的培养液后重悬菌体，最后，全部均匀涂布到含卡那霉素的LB平板上，在37°C培养箱中培养过夜。
挑取单克隆并保菌
向96孔板中加入100μL含有卡那霉素的LB培养基，然后从LB培养板上挑取单克隆菌落加入96孔板中。再置于37℃的摇床中180rpm震荡培养1h。
菌体PCR及高通量蛋白表达
从震荡培养1h的96孔板的每个孔中取出1μL培养基，作为模板加入PCR体系。在经过适当的PCR程序后，取5μL PCR反应体系，作为模板加入无细胞表达体系。表达4个小时后，即可在体系中产生目的蛋白酶——phi29 DNA 聚合酶。
活性测定
Phi29 DNA聚合酶的活性测定是利用聚合酶活性来扩增绿色荧光蛋白基因的线性模板，通过最终产物绿色荧光的强度对phi29 DNA聚合酶的活性做出判断。首先从最终的无细胞反应体系中直接取出1μL的反应上清液作为酶溶液加入到扩增体系，该体系含有使phi29起效的缓冲液、绿色荧光蛋白基因的质粒模板以及扩增所需的引物。然后在42℃的条件下扩增2h生成线性模板。最后取5μL的线性模板加入到终体积为50μL的无细胞反应体系中，6小时后测定其荧光值，找出活性较强的phi29 DNA聚合酶突变体。
活性结果
在激发波长485nm发射波长535nm的条件下，测定绿色荧光蛋白的荧光值。不同孔中的荧光值有明显的不同，表明不同phi29 DNA聚合酶的突变体有不同的活性强度。
突变测序
测定活性之后，从之前保存的96孔培养板上取活性强度较高的几个孔位所对应的菌体，扩大培养后进行测序操作。我们成功找到了在此板上活性强度前三位的phi29 DNA聚合酶突变体。其在221位和350位的氨基酸组合如下所示。
总结
通过上述实验，我们展示了一种基于珀罗汀无细胞蛋白表达技术的高通量筛选、验证突变体酶的方案。该方案在3天内完成了近百种突变蛋白的构建表达及活性验证，显著缩短了蛋白筛选的时间，减少了人工操作成本，可极大提高研发效率。
除了本文展示的方案，珀罗汀生物还建立了一种通过引物引入突变，并直接通过PCR获得线性模板的高通量筛选方案，并利用该方案在一天内完成了近百种GFP突变体的筛选。具体方案将在后续文章展示，敬请期待！