ELISA实验做不好？笃玛为您汇总了以下问题

ELISA（免疫酶联吸附实验）是免疫学基础实验之一，大部分生命科学领域的科研工作者对其都不陌生。因为其特异性强，灵敏度高，可精确定量的特性，在基础科研和临床诊断中，ELISA技术都应用广泛，相信很多关注我们的小伙伴也都做过ELISA。

Q: ELISA可以检测胞内蛋白么？

A: 可以的，大部分ELISA指标均为炎症因子、趋化因子等分泌类型蛋白，支持的样本类型也多为血清、血浆、细胞培养上清等液体样本。如需检测胞内蛋白，首先需要确认待测指标是否在胞内表达，然后选用支持组织匀浆样本的ELISA试剂盒即可，将组织样品或细胞样品进行裂解，提取胞内蛋白后进行蛋白定量，保证每孔上样总蛋白量一致即可。

Q: ELISA可以测DNA的表观么？

A: 不可以，ELISA是利用免疫学原理，定量检测蛋白质表达的技术。测DNA表观遗传学，主要是检测DNA甲基化，可以选用ChIP技术。

Q: 夹心法ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么？

A: 不是的，在双抗夹心法ELISA实验中，会同时用到捕获抗体和检测抗体，这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体，这样才可以同时结合抗原分子。这也是双抗夹心法ELISA不适用与小分子抗原和半抗原等待测指标的原因。

Q: 试剂盒里面有捕获抗体么？

A: 即用型ELISA试剂盒中，捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上，没有单独的捕获抗体提供，直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。非即用型的ELISA试剂盒会有捕获抗体提供，需按照说明书推荐的工作浓度，用稀释液稀释后自行包被。

Q: 捕获抗体如何包被在96孔板上？

A: 如果选用的是即用型ELISA试剂盒，无需进行抗体包被，因为试剂盒中的检测抗体已经事先包被在检测板中；如果是非即用型的ELISA试剂盒，需要自己在实验前提前进行抗体包被，简要步骤入下：首先，要选择ELIS别的板子，材质应为聚苯乙烯；然后用抗体包被液将捕获抗体稀释（pH9.6的碳酸盐缓冲液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl）成工作浓度，再每孔加100 μl（96孔板加样量）稀释后的捕获抗体，室温或4℃过夜包被，然后进行洗板和封闭之后再次洗板即可使用，如需长期保存，则需要真空冻干后保存。

Q: ELISA实验中，酶标抗体是什么抗体？识别的目标又是什么？

A: 这个问题需要具体分析，在直接法ELISA中，酶标抗体直接识别抗原，即可检测，但缺少二抗放大，且灵敏性不高。在间接法ELISA中，酶标抗体作为二抗，识别检测抗体。而在目前应用的双抗夹心法ELISA中，酶标抗体识别的也是检测抗体，对检测抗体进行识别和酶标记。

Q: 试剂盒有推荐样本稀释浓度还需要自己测吗？

A: 试剂盒一般会给出不同样品类型的的推荐稀释比例，但是为大致范围，最好还是根据自己的样本情况，设计预实验测量计算。尤其是待测蛋白为炎症因子时，因为在不同组别样本间差异巨大，更是需要预实验检测后稀释。

Q: 做实验前怎么知道待测血清中炎症因子的范围呢？多大是高多小是低？

A: 需要根据文献推测，一般在健康人样本中，炎症因子表达很低，接近ELISA检测下限，样品无需稀释或1:1稀释即可，如已知为炎症疾病或造模样本，可参考文献，在预实验中设置1:10-100（或更高）的稀释比例，预实验检测后确定最佳浓度进行正式实验。

Q: ELISA实验中，检测计算抗原的浓度，临界值怎么确定？

A: 根据曲线测定的浓度，建议落在标准曲线的中间位置较好，极限最好不要超过标准曲线的上下限，如果超出较多，会影响计算结果准确性，建议调整稀释比例。

Q: 配好的抗体没用完如何保存，可保存多久？预实验用了一个试剂盒里面的部分板子和试剂，剩下的板子和试剂还能继续用于正式实验吗？

A: 针对爱必信的ELISA试剂盒来讲，在说明书中有各组分拆开后的保质期，配好的母液和拆封的板子，可以在四度保存，保质期为一个月左右。剩下的板子和试剂在保质期内是可以继续用于正式实验的，为保证实验质量，还是建议间隔时间不要太长，一周之内更好，需注意试剂避免污染，板子保持干燥。