ELISA实验中会遇到的情况

Q：in vivo实验周期长，不太好做预实验，对ELISA结果会有影响么？怎么办？

A：如果您实验室之前建立的in vivo实验protocol经过验证，可以保证有效性，那么，可以不用再进行相关的预实验；并且，如果实验周期较长，样本获取不易，同时又需要检测较多指标，建议将样品分装冻存，避免反复冻融。ELISA实验还是建议进行一下预实验，摸清楚样本的最佳稀释比例，取得更好的实验结果。

Q：检测样本是细胞培养上清，那么细胞数目对炎症因子的浓度有影响吗？

A：有影响，所以不同样本可以比较的前提条件是培养细胞数水平接近一致。因不同处理，可能会导致细胞生产状态不同，要保证在铺板时接种细胞数量水平一致。

Q：打开试剂盒，发现wash buffer析出结晶，对实验结果有影响么？怎么办？

A：wash buffer为高浓度盐溶液，在低温保存条件下，有可能出现结晶析出，为正常现象，可以放在37℃或55℃烘箱中，析出的结晶会溶解，溶解后可正常使用。不可以在结晶存在的情况下配置wash buffer。

Q：笃玛生物的ELISA试剂盒显色液是双组份的，有些其他品牌的是单组分的，使用单组分的有影响么？

A：HRP酶标二抗的ELISA试剂盒，显色底物一般为TMB，TMB不稳定，曝光或污染氧化后会出现显色反应，导致实验背景升高，或无法使用，所以笃玛生物的ELISA试剂盒将显色液调整为双组份，方便稳定保存，仅在使用前混合，避免了TMB的不稳定影响实验结果。如您选用的试剂盒为单组分显色液，在使用前检测是否为无色透明，如果是正常的，对结果也没有影响，可以放心使用。

Q：同一样品多次ELISA检测，测试结果差异大怎么解决？

A：应考虑的问题包括：

样本保存不当，会导致多次实验结果偏差较大，样本应尽量减少反复冻融，如需多次检测，需在取样后分装保存；

样品冻融之后未混匀，应混匀后再上样；

加样准确，微量样品加样时要注意移液器枪头不要有残留。

Q：副孔差别比较大，是没洗干净吗？

A：复孔值差异较大，主要原因应考虑加样是否准确，洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。加样应注意移液器量程，以及枪头残留问题；洗板过程应注意不要有残留液体，需要进行拍干操作；孵育过程要更换封板膜，拍干过程要换吸水纸，避免交叉污染。

Q：加完终止液之后测的几次数据差别也蛮大，是什么原因？

A：加完终止液后，显色反应也不是永远停止，形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深，建议在15 min内读数。

Q：整个过程需要避光吗？避光需要避到什么程度呢

A：ELISA实验中，在酶标抗体孵育，以及显色底物孵育这两步建议避光，其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹，或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。

Q：封板膜什么时候用？每次加液后都要换吗？

A：封板膜在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体时，都要盖好封板膜，减少挥发及污染几率。每次使用后要更换新的封板膜。

Q：ELISA实验中的洗板步骤如果没有洗板机，需要如何操作？

A：实验室ELISA实验做的较多，还是建议使用洗板机洗板，效果更好，也更方便控制。如果没有洗板机，在洗板过程中，需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出，在加洗板液后，静置1-2min，甩干液体后，在吸水纸上大力拍干；重复三次。

Q：手动洗板过程中，拍过抗体或抗原的滤纸需要扔吗？

A：是需要更换的，防止造成交叉污染，影响实验结果的准确性。

Q：ELISA实验中，检测计算抗原的浓度，临界值怎么确定？

A：根据曲线测定的浓度，建议落在标准曲线的中间位置较好，极限最好不要超过标准曲线的上下限，如果超出较多，会影响计算结果准确性，建议调整稀释比例。

Q：因为检测限的原因，同一块ELISA板子，样本稀释比例不同，部分样本1:10稀释，部分1:20稀释，这样设置可行吗？结果可以比较吗？

A：可以比较，不同稀释比例，是因为不同样本间的表达差异较大，只要保证稀释后的检测样品测量值准确，还原回稀释倍数后的浓度是可信的。可以用来比较不同样本的原始浓度差。

Q：测得的值都低于标准曲线的值，是什么原因，应该怎么解决？

A：这种情况需要设置实验对照组来排查，建议在实验组别设置中添加阳性对照孔，用明确表达的样品作为阳性对照，如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度，则表明实验成功，检查其他待测样品是否稀释倍数过高，可以降低稀释比，直至直接加样本原液，如还检测不出，则表明该指标在其余待测样品表达含量低于检测下限，按照0计算即可。这种情况尤其对于炎症因子较为常见，在健康样本中，表达含量极低。

Q：标准曲线在推荐的浓度下，r2值为0.9，做了多次都是这样，怎么办？

A：这种情况首先要仔细核对产品说明书，看是否用了推荐的拟合方法，如笃玛生物的ELISA试剂盒，需要使用四参数拟合方式进行拟合，用错拟合方式，会导致r2值较低；如拟合方式无误，需检查是否有个别标曲孔数值异常，排查实验过程中是否出现污染或标准品倍比稀释时出现失误，导致加样不准。

Q：试剂盒推荐用450和570nm双波长检测，但条件有限可否换成450和620的双波长？如何使用校准波长？还有，用空白孔校准可以么？

A：可以的，TMB底物显色后，吸光峰值在450nm，另外的校准波长是防止气泡等杂质造成的干扰设置，避开450左右50nm以上即可。两次读取的OD值，用OD450 - OD校准波长即可。尽量还是建议有条件的选用双波长校准的方法，因为避免了不同孔的读数影响，防止出现空白孔污染，导致读数较高，无法校准的情况。

Q：样本总是在标准曲线之外，稀释100倍也是，怎么办？

A：在设置稀释倍数之前，需要参考相关文献，对于一些表达的蛋白，确实会出现这种情况，之前小编接到过的案例，样品需要稀释10000倍，目的蛋白才落在检测区间内。建议继续提高稀释比例。

Q：最后显示的OD值在多少之间属于可用值，有要求吗？

A：有的，建议标准曲线最高浓度点的OD值在2.0左右较好，也可参考说明书标曲的数据。