土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（S-NAG）活性检测试剂盒说明书
时间：2024-05-14 阅读：157
土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（S-NAG）活性检测试剂盒说明书
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
微量法
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入2mL丙酮溶解，用不完的试剂仍-20℃保存； 试剂三：液体30mL×1 瓶，4℃保存；
标准品：液体1mL×1支，5 mmol/L的对硝基苯酚溶液，4℃保存。临用前用试剂一将标准品稀释50倍得100μmol/L 的标准溶液。
产品说明：
土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（S-NAG）是土壤微生物分泌的溶酶体中的一种酸性水解酶。其活性变化与机体某些病理状态密切相关。
S-NAG分解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算NAG活性。
自备实验用品及仪器：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰、30-50目筛（或更小）和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理：
新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30-50目筛。二、测定步骤：
（1） 分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至400nm，蒸馏水调零。
（2） 加样表：
试剂名称 | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
风干土样（g） | 0.03 | 0.03 | - | - |
试剂一（μL） | 165 | 165 | - | - |
试剂二（μL） | 15 | - | - | - |
混匀，37℃水浴1h 后，立即沸水浴5min（盖紧， 防止水分散失），流水/冰浴冷却。 | - | - | ||
试剂二（μL） | - | 15 | - | - |
12000g 25℃离心10min，取上清液 | - | - | ||
上清液（μL） | 100 | 100 | - | - |
标准品（μL） | - | - | 100 | - |
蒸馏水（μL） | - | - | 100 | |
试剂三（μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
室温静置2min 后，10000g 常温离心5min，吸取200μL上清于微量玻璃比色皿或直接在96孔板中，测定400nm处的吸光值A。分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA=A 测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A 空白管。每个测定管设一个对照管。 | ||||
三、S-NAG 活力计算：
单位的定义：每天每g土样中产生1 μmol 对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
S-NAG活力（U/g 土样）＝ΔA÷ (ΔA标准÷C标准)×V 反总÷W÷T =0.432× ΔA÷ ΔA标准÷W。T： 反应时间，1h=1/24d；V 反总：反应体系总体积：1.8×10-4 L；C标准：标准溶液浓度，100μmol/L；
W：样本质量。
注意事项：
1、当ΔA 大于 1 时，建议将上清液稀释后进行测定；当ΔA 小于 0.02 时，建议延长反应时间。计算公式中注意乘以稀释倍数或注意反应时间变化。