土壤几丁质酶试剂盒说明书
时间：2024-05-14 阅读：155
土壤几丁质酶试剂盒说明书
注意：正式测定之前选择2-3 个预期差异大的样本做预测定。
货号：DM-W-B917
规格：100 管/48 样
产品内容：
缓冲液：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存，使用前摇匀。试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
微量法
标准品：粉剂×1 瓶。5mg N-乙酰氨基葡萄糖，4℃保存。临用前加入 2.27mL 蒸馏水配成10μmol/mL 的标准溶液。
产品说明：
几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中，而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。
几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与 3,5-二硝基水杨酸产生棕红色化合物， 在540nm 处有特征吸收峰，吸收值增加速率反映了几丁质酶的活性。
需自备的仪器和用品：
天平、水浴锅、离心机、震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板，甲苯、蒸馏水。
操作步骤：
1、可见分光光度计/酶标仪预热 30min。波长调至 540nm，蒸馏水调零。
2、将标准溶液稀释为 5、4、3、2、1μmol/mL 的标准溶液备用。
3、在 EP 管中分别加入：
试剂名称 | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
土样(g) | 0.02 | 0.02 | - | - |
甲苯（μL） | 10 | 10 | - | - |
缓冲液（μL） | 120 | 40 | - | - |
试剂一（μL） | - | 80 | - | - |
混匀，37℃震荡培养1h，8000rpm，4℃，离心10min，取上清100μL，再加入下列试剂 | ||||
蒸馏水（μL） | - | - | - | 100 |
上清液（μL） | 100 | 100 | ||
标准溶液（μL） | - | 100 | ||
试剂二 | 40 | 40 | 40 | 40 |
蒸馏水 | 100 | 100 | 100 | 100 |
混匀，沸水浴10min，立即置于冰上至室温。取 200μL 于微量石英比色皿/96 孔板中，测定 540nm 处吸光值，记为A 测定管、A 对照管、A 标准管、A 空白管。计算ΔA 测定=A 测定管- A 对照管，ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。 | ||||
三、计算公式
标准曲线的建立：以浓度（y） 为纵坐标，ΔA 标准（x）为横坐标建立标准曲线。
以ΔA 标准为 y 轴，标准溶液浓度为 x 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b。将ΔA 测定带入标准方程中，得到 x（μmol/mL）
酶活性定义：37℃条件下，每克土壤每天分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活力（U /g 土样）＝ y×V 反总÷W÷T =3.12×y÷W
T：反应时间，1/24d； V 反总：反应体系总体积：0.13mL；W：样品质量，0.02g。