α-黑素细胞刺激素(α-MSH)负责触发褪黑激素的产生，褪黑激素是人体抵御紫外线(UV)辐射的天然保护。皮肤暴露于紫外线会促进α-MSH的产生；然而，在紫外线暴露前刺激褪黑激素的生物合成可能会预防紫外线诱导的皮肤癌。
 

　　考虑到天然形式的α-MSH在体内太不稳定而不能作为治疗剂施用，人们合成了不同的类似物，其中之一是MT-II(图1)，一种对酶降解具有高抗性和非凡效力的环状类肽。
 

图1
 

　　由于MI-II的生产往往需要放大到KG级别以满足临床需求，因此在实验室规模的工艺条件优化必须考虑到工艺的可放大性。
 

　　
 

　　Gyros Protein Technologies 提供从实验室到中试级别的多肽合成仪，帮助从工艺开发阶段顺利放大到商业化生产。
 

　　本文案例将讨论全自动合成的途径的优化和放大，即线性序列的合成和最终肽的树脂上内酰胺化。在这项工作中， MT-II大规模合成的优化分三个阶段进行：
 

　　1找到树脂上环化的适当保护方案；
 

　　2使用PurePep Chorus小规模优化合成条件并完成环化，仪器全自动运行；
 

　　3在中试规模合成器PurePep Sonata+上，利用先前优化的条件放大合成MT-II。
 

　　01寻找合适的树脂上环化保护方案
 

　　MT-II的结构在天冬氨酸和赖氨酸之间形成内酰胺桥后完成，并且这些残基需要在树脂上环化步骤之前选择性地去保护。因此，理想的是找到可以伴随去除的侧链保护基团，以最小化脱保护的难度。本实验第一阶段中，使用不同组合的侧链保护基团合成MT-II：
 

　　1Asp(ODmab)/Lys(ivDde)
 

　　2Asp(O-2-PhiPr)/Lys(Mtt)
 

　　3Asp(OAlly)/Lys(Alloc)
 

　　可以分别用2%肼的DMF溶液、1%TFA的DCM溶液以及钯-四(三苯基膦)(Pd(PPh3)4)和苯基硅烷(PhSiH)的DCM中溶液同时且选择性地除去。最终肽的粗纯度示于表1中。
 

表1 不同组合侧链保护基团合成的MT-II粗肽纯度
 

　　当比较不同的保护方案时，组合2获得的粗肽纯度最高。然而，Fmoc-Asp(O-2-PhiPr)-OH相对昂贵，会给后续的放大生产增加成本。组合1获得的粗肽纯度最低，这归因于通过用2%肼处理对ODmab和ivDde的去保护效果不佳。此外，尽管组合3呈现出比组合2低得多的粗纯度，但经过分析这主要与天冬酰胺的形成有关。通过最小化该副反应，可以显著提高粗肽纯度。因此，选定Asp(OAlly)/Lys(Alloc)作为合成MT-II单体并进行下一步优化。
 

　　02 小规模优化缩合条件
 

　　我们首先研究了DIC和OxymaPure用于偶联步骤，没有预活化(4)和预活化5分钟(5)。与组合3一样，由于天冬酰胺的形成，这些方法导致粗肽纯度显著降低(表2)。因此，MT-II以逐步方式合成：将肽合成至His(His-D-Phe-Arg-Trp-Lys(Alloc)-树脂)，并用HCTU/NMM(6)或DIC/OxymaPure(7)进行Asp(OAlly)的缩合。在Asp(OAlly)缩合后，进行微切割，其中没有观察到天冬酰亚胺的形成。这些片段的粗纯度为88.9%。
 

表2 不同条件下合成MT-II 的纯度
 

　　线形肽的合成
 

　　线性MT-II在PurePep Chorus上以100 μmol规模在Rink Amide MBHA树脂(0.35 mmol/g)上合成。在合成之前，将树脂在DMF中溶胀2 ×10分钟。脱保护步骤用20%哌啶DMF溶液进行2 × 5分钟，缩合步骤用5当量AA，5当量DIC和5当量OxymaPure DMF溶液中的(无预活化-4，或5分钟预活化-5)，在室温下持续30分钟。对于片段7和9，Asp(OAlly)和Nle在与5相同的条件下缩合。对于片段6和8，在室温下，将Asp(OAlly)和Nle与HCTU(5当量)和NMM(10当量)在DMF中缩合，预活化时间为5分钟，单次缩合时间为30分钟。MT-II的末端胺在室温下用10% Ac2O的DMF溶液乙酰化30分钟。
 

　　Asp和Lys侧链保护基团的选择性去除：Asp(OAlly)和Lys(Alloc)的脱保护用0.2当量Pd(PPh3)4在24当量PhSiH的DCM溶液在室温下洗涤两次60分钟，然后用DCM和DMC各洗涤3次。
 

　　树脂上环化
 

　　在室温下，用吡肟(5当量)和DIPEA(5当量)在DMF溶液中进行树脂上环化60分钟。
 

　　切割
 

　　树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤6次，然后干燥20分钟。每次切割用TFA/EDT/H2O/TIS(94：2.5：2.5：1)的混合物在室温下进行60分钟，然后在乙醚中沉淀。
 

　　03在PurePep Sonata+ 上放大MT-II 的合成
 

　　在PurePep Chorus上小规模优化合成后，得出方案8为最优方案。在PurePep Sonata+上大规模(5 mmol)合成MT-II。
 

　　根据方案8的合成方法和条件，MT-II在PurePep Sonata+ 上合成直至Asp(OAlly)【Fmoc-Asp(OAlly)-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys(Alloc)-树脂】，之后选择性除去侧链保护基团，用于随后的树脂上环化。环化后，通过加入Nle和N-末端乙酰化完成序列。按照该策略，获得了粗纯度为80.2%的MT-II，这与在 PurePep Chorus上合成0.1 mmol规模的粗肽纯度相当。
 

　　结论
 

　　● 在PurePep Chorus 多通道多功能全自动合成仪，可以实现小规模MT-II的合成并对不同合成条件进行探索和优化，随后可顺利将最优合成条件放到到PurePep Sonata+上进行，合成规模从100µmol放大到5mmol(增加50倍), 得到的粗肽纯度几乎一致为80.1%。
 

　　● 该研究得益于PurePep Chorus的灵活性，MT-II是从头到尾全自动合成：从线性多肽到选择性侧链脱保护和树脂上环化，每一步选择不同的缩合条件，并且可在合成过程中进行在线微切割提取样品进行测试，以便根据实验结果调整条件。在PurePep Chorus上的工艺的可顺利转移放大到PurePep Sonata+ 并得到相同的结果。