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　　使用多功能多通道的 PurePep Chorus 对 PNA 合成条件进行快速优化
 

　　肽核酸(简称 PNA )是具有类多肽骨架的 DNA 类似物，且具有多种物理化学性质。PNA 的主链骨架是由 N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。
 

图1：肽核酸的结构示意图，及与 DNA 键合
 

　　肽核酸非离子核酸类似物，由于 PNA 不带负电荷，与 DNA 和 RNA 之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高，与 DNA 或 RNA 分子的杂交能力远优于 DNA/DNA 或 DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。
 

　　PNAs可以通过 RNAs 结合互补从而抑制基因表达。并且在特定的条件下，也可以通过链入侵机制与 DNA 双链序列结合来促进基因表达。基于以上优势特点，近十年来 PNA 被广泛用于多个领域，高亲和力和特异性使它们不仅成为治疗剂，而且在诊断的应用中也成为有力的工具。
 

　　随着 PNA 基础研究的不断深入和新技术的不断出现，PNA 将显示出更好的性能和更为广阔的应用前景。
 

　　目前的挑战
 

　　由于合成过程中容易发生聚合，且脱保护过程中有很多副反应，PNAs 的合成具有较大的挑战。针对容易聚合的问题，通常的策略是在缩合反应中使用过量的试剂。但是，用于合成的 N 端保护的 PNA 单体试剂价格相对较高，该方法没有得到广泛应用。因此，必须开发出相对经济高效的合成工艺才能帮助PNAs 成功实现商业化。
 

　　在 PurePep Chorus 上进行合成条件的优化
 

　　在本文中，我们将展示在 PurePep Chorus 自动合成仪上实现对 PNA 的合成条件的的快速优化。
 

　　PNA 1 将用于参考序列以考察不同的合成参数，如 PNA 单体的过量系数、反应时间以及温度。合成出 PNA 1 纯度最高的条件将被用于合成其他5条长度及嘌呤(腺嘌呤及鸟嘌呤)含量不同的序列(见表1)。纯度是考察合成的一个关键因素，由于 PNA 单体的空间位阻大，容易引起缩合反应不完全导致低纯度。
 

　　表1：此次案例中涉及的 PNA 序列信息
 

　　PNA 1 使用 PurePep Chorus 多肽合成仪合成，合成当量为 25 μmol，使用了取代度为 0.27 mmol/g 的 Rink Amide MBHA 树脂，并遵循 Fmoc/tBu 正交保护方案。树脂上 Fmoc 基团的脱保护使用20%哌啶  DMF 溶液，在室温下反应 5分钟×2 次；缩合反应使用 HCTU 和 NMM 的体系，具体的反应细节见表2。缩合反应结束后执行封端的操作，使用10%醋酸酐  DMF 溶液，室温下反应5分钟。最后一步脱保护结束后，将树脂放在切割液(TFA: TIS: H2O=95: 2.5: 2.5)中，室温下反应4小时。
 

　　以上操作可在 Chorus 上根据所需条件在软件上设置不同 Protocol，软件自动计算所需试剂量，仪器自动运行，更大化节省人工操作，并且确保试验方案被严格执行。
 

　　表2 缩合条件的研究
 

　　从表2 的数据分析我们可以发现当 PNA 的反应当量数为10倍时，产物粗品的纯度达到81%；然而基于合成原料 Fmoc-PNA 单体价格高，上述的设计不易被接受。将 PNA 的反应当量系数降低到4倍，产物粗品的纯度降低到 72%。此时维持 PNA 的反应当量系数在4倍，将反应温度升至 45℃ 并减少缩合时间至 5 分钟，产物粗品的纯度进一步下降到 61%。由此可见，对于缩合反应而言5分钟反应时间太短。此时其他条件不变，单独将反应时间增加到10分钟(实验D)，粗肽纯度达到了82%，与实验A的结果相近。实验E用于进一步考察反应的条件，反应当量系数调整为2，且做了2次加样反应。使用了总量相同的反应原料并在相同的缩合时间下，产物粗品的纯度提高了5%。
 

　　我们根据 PNA 1 产物纯度的最高值确定了合成条件，剩下的几条序列将使用与 PNA 1 相同的方式合成(即方法E)。结果在表3中显示：
 

　　表3：使用方法E合成其余5条 PNA 的粗品结果
 

　　上述5条 PNA 合成后产物的粗品纯度在66-91%之间，这样的结果对于肽核酸而言令人满意。有趣的是，嘌呤含量更高的 PNA 产物拥有更高的纯度。
 

　　图2：5条 PNAs 产物用 UPLC-UV 系统在210nm波长下采集的色谱图。UPLC系统为 Waters H-class UPLC/ESI-MS，色谱柱为C18 (1.7 μm,2.1 x 50 mm) 。流动相为0.1% TFA在水(A)与乙腈(B)混合溶液。
 

　　总结
 

　　在此应用文献中，我们详细讨论了使用 PurePep Chorus 系统优化 PNA 合成的方法。最初我们使用了10倍反应当量的 PNA 在室温下缩合反应1小时，这样的方法可以获得纯度达到81%的产物粗品。我们致力于降低反应物的用量，并将其对粗品纯度的影响降到最低从而让该反应更加经济、可持续、更符合绿色化学的要求。最终我们开发出了既减少反应物用量，纯度又高的方法。使用2次缩合的方式，每一次加样用2倍的反应当量，在45℃条件下反应5分钟，可以将PNA 1的粗品纯度从81%提升到87%。最后该方法倍应用到了其他5条 PNA 的合成上。
 

　　对于不同长度及不同嘌呤含量的肽核酸，该方法都能得到很不错的产物。PurePep Chorus 多肽合成仪对该工作是一个很好的工具，因为合成的方案可以根据需要灵活调整；比如修改反应当量系数、重复次数、温度及时间。同时，自动化的仪器及软件的自动计算功能帮助减少人工操作，降低失误风险，优化后的合成条件可以被轻松的应用于其他 PNAs 合成。