荧光原位杂交（FISH）探针的制备

实验原理

染色体荧光原位杂交始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，这种结合开创了一门新的学科——分子细胞遗传学。其基础是Southern blot原理，以半抗原如生物素标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记的亲和素将半抗原显示出来，通过荧光显微镜观察杂交信号。FISH具有快速灵敏、特异性好的特点，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行定量；可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。

实验步骤

第一天

缺口平移标记探针

1. 试剂准备

   1） 0.1mmol/L dNTP

0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等体积混合。

   2） 0.1mmol/L dTTP

1倍体积的0.3mmol/L dTTP和2倍体积的三蒸水混合。

2. 缺口平移体系和反应条件

0.1mmol/L dTTP 6.5μl

0.1mmol/L dNTP 10μl

10× Nick Translation buffer 5μl

1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl

Nick Translation Enzyme 10μl

DNA (1μg) X μl

H₂O 18-X μl

in total 50μl

以上为标记1μg DNA的缺口平移体系，若标记更多量的DNA，则试剂量和反应体系相应等倍扩大。各成分混匀后短时离心。对于≤10kb的质粒，于15℃反应3.5小时；对于BAC/PAC，于15℃反应9小时。

3. 凝胶电泳判断探针大小

将EP管置于冰上，取其中5μl 于70℃加热5分钟后行2 ％琼脂糖凝胶电泳以观察所标记探针的大小，单一序列探针合适大小为200～600bp；如片段大小偏大，则于15℃延长反应10～30分钟，再重复进行凝胶电泳，直至得到合适大小的探针。

4. 终止反应

向反应体系中加入1μl 0.5M EDTA和（或）70℃加热5分钟，以灭活酶。探针于-20℃保存备用。

第二天

1. 探针的沉淀和变性

   1) 探针混合物的组成

      a. 对BAC/PAC探针

DNA探针 5ul

Human Cot-1 DNA 3ul

Salmon Sperm DNA 0.5ul

H₂O 1.5ul

in total 10ul

      b. 对着丝粒探针：

DNA探针 5ul

Salmon Sperm DNA 0.5ul

H₂O 4.5ul

in total 10ul

   2) DNA的沉淀

将探针混合物与1ul（V/10）3M醋酸钠（PH5.2）和27.5ul（2.5V）无水乙醇（-20℃冻存）混合，-80℃沉淀30min（或-20℃沉淀过夜），以14000g在4℃离心30min，以沉淀DNA。

   3) 清洗沉淀

小心弃去上清，用70 ％乙醇洗涤一次，再次以14000g在4℃离心15min；小心弃去上清，在45～50℃的中温水浴中风干DNA沉淀10～15min。

注：当大部分乙醇蒸发时，白色的DNA沉淀变为半透明状；务必清除乙醇，否则会在加入Master Mix后产生微小的沉淀，导致高背景。

   4) 溶解探针

加入5μl 预热至37℃的去离子甲酰胺（PH 7.0），短时离心后在37℃振摇30min以充分溶解DNA；再加入预热至37℃的Master Mix 5μl，短时离心后在37℃振摇15～30min。

注：振摇时间尽可能延长；DNA沉淀亦可以TE缓冲液1.1μl溶解后加入Vysis探针缓冲液4.4μl稀释，混匀后瞬时离心，37℃振摇15～30min。

   5) 探针的变性和预杂交

短时离心后于80℃水浴中变性探针10min，冰浴5分钟；短时离心，于37℃水浴中预杂交30～60min；序列探针（如cDNA）和重复序列探针（如α-卫星DNA）探针，无需预杂交。

2. 标本（染色体靶DNA）的处理和变性

   1) 滴片和老化

取出储存于-20℃的细胞悬液标本，以1100 rpm.离心10min沉淀细胞，换用适量体积的新鲜甲醇:冰乙醇（v/v）＝3:1固定液重悬细胞并调整细胞密度，滴片，划出杂交区域，晾干；在预热到 37℃的2×SSC中老化30min（也可实验前夜室温过夜老化再以2×SSC浸泡2分钟）；依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脱水，每缸2min，晾干（以下略作“梯度乙醇脱水后凉干”）。

   2) RNase A消化

每张玻片上加30μl 100μg/ml RNA酶（将10mg/ml的RNase A储存液稀释100倍），盖上22×22mm盖玻片，置于37℃湿盒中孵育1小时；室温下2×SSC中振荡洗涤，5min/次×3次；梯度乙醇脱水后凉干。

   3) 靶DNA的变性

将玻片放入预温至72℃（每增加一张玻片，温度要提高1℃）的70 %去离子甲酰胺/2×SSC中变性2分钟后，立即置入预冷至-20℃保存的梯度乙醇脱水晾干。

   4) 蛋白酶消化

将50μl 100 mg/ml的胃蛋白酶（终浓度为0.01 ％）加入预温至37℃的50ml蒸馏水（PH 2.0，以适量稀盐酸酸化）中，混匀；将变性后的玻片放入其中处理10分钟；室温下1×PBS中振荡洗涤，5min/次×2次；室温下梯度乙醇脱水后凉干。

注：靶DNA的变性和消化应与探针变性同步进行，完成后尽快进行杂交。

3. 杂交

将变性后的DNA探针加于玻片杂交区域，盖上22mm×22mm盖玻片，封片后置于湿盒中，37℃杂交过夜。

第三天

1. 杂交后洗涤和半抗原信号放大

   1) 杂交后洗片

小心揭去封片胶和盖玻片，将玻片置于预热至46℃的50 ％甲酰胺/2×SSC中，5min×3缸；将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸；每张玻片滴加30 μl阻断液1，盖上22mm×22mm盖玻片，于37℃湿盒中孵育30min；再次将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。

注：此后步骤应注意避光操作。

   2) 滴加一抗

将4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中，混匀；每张玻片滴加25 μl 于杂交区域，盖上22mm×22mm盖玻片，于37℃湿盒中孵育1小时；室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。

   3) 滴加二抗

将4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中，混匀；每张玻片滴加25 μl 于杂交区域，盖上22mm×22mm盖玻片，于37℃湿盒中孵育40min；室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。

   4) 滴加三抗

将4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中，混匀；每张玻片滴加25 μl 于杂交区域，盖上22mm×22mm盖玻片，于37℃湿盒中孵育30min；室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。

注：以上步骤按双色FISH描述，若为单色FISH则选择相应抗体即可。

2. 核复染和抗荧光淬灭剂封片

将1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中（终浓度为125 ng/ml，避光保存于4℃），混匀；将玻片置于其中，避光复染2min；2×SSC中洗涤5min；梯度乙醇脱水晾干；每张玻片滴加10 μl 抗荧光淬灭剂封片，盖上22mm×22mm盖玻片，-20℃避光保存。

3. 荧光显微镜检测FISH杂交信号

以荧光显微镜观察，在DAPI/FITC/Texas Red滤光镜激发下观察中期/间期细胞的荧光杂交信号，计数细胞和采集图像。每例分析100～200个间期细胞核细胞，重叠、破损、未去除细胞质和杂交信号微弱的细胞核不计入其中。对于双色双融合FISH，细胞内杂交信号相互靠近（<1/10核直径的距离）者计为一个信号。

4. 储存数据