作者单位：1（安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036）2(安徽省兽医工作站，合肥 230022）3（安徽农业大学生物技术中心，合肥 230036）

【摘要】  本研究建立了基于基质固相分散萃取（MSPD）液相色谱紫外检测法（HPLC/UVD）的同步检测鸡组织中地克珠利和妥曲珠利残留的快速、和经济的新方法。正交试验优化后的基质固相分散萃取的*条件如下，预混有地克珠利和妥曲珠利混合标准溶液的0.5 g鸡组织匀浆在研钵中与2 g Cl8填料研匀，静置2～5 min后装萃取柱；萃取柱自底层到上层依次装入玻璃棉、1.5 g 无水Na2SO4、样品混合物、0.5 g无水Na2SO4; 压紧后依次用8 mL正己烷、8 mL甲醇水溶液（1∶4, V/V）淋洗， 8 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，50℃旋转蒸发，0.5 mL 流动相溶解，过0.22 μm 滤膜后进样检测。*色谱条件为C18分析柱（250 mm×4.6 mm i.d.， 5 μm）；流动相：0.05 mol/L H3PO4三乙胺(pH 3.0)乙腈(40+60)；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm，AUFS =0.05；进样体积：20μL；柱温：20℃。该检测方法的定量线性范围为50～1000 μg/L。在50、500和1000 ng/g的添加水平，地克珠利和妥曲珠利从鸡组织中的回收率范围为71.1%～84.0%，相对标准偏差的范围为3.8%～12.1%；同时方法的日内和日间相对标准偏差范围为3.70％～ 6.77%。地克珠利的检出限为8 ng/g（肌肉）和10 ng/g （肝、肾），妥曲珠利的检出限为 7 ng/g（肌肉）和10 ng/g （肝、肾）; 地克珠利的定量限为12 ng/g（肌肉）和15 ng/g （肝、肾），妥曲珠利的定量限为 10 ng/g（肌肉）和15 ng/g （肝、肾）。

【关键词】  基质固相分散萃取，液相色谱紫外检测法，地克珠利，妥曲珠利，鸡组织

基金项目：“十一五国家科技支撑计划”分课题（2006BAK02A08４）、安徽省“十五”科技重大攻关项目（0400303041）、安徽省青年基金(04041042)

1 、 引  言

    地克珠利(diclazuril, DIC)和妥曲珠利(toltrazuril, TOL)属均三嗪类抗球虫药，被广泛用于畜禽球虫病防治[1]。食品添加剂联合专家委员会(JECFA)(1996，1998)和欧盟药品管理局（EMEA）(1996，2004）在对地克珠利和妥曲珠利的毒理学研究数据评估后，制定了日允许摄入量和zui高残留* [2～5]。

    均三嗪类抗球虫药在畜禽生产中的广泛应用，迫切需要建立一种灵敏的均三嗪类药物残留分析方法。欧盟药品管理局在其评估报告中推荐使用气相色谱电子捕获检测(GCμECD)检测羊、猪和牛的可食性组织中地克珠利的残留 [2，3]。祁彦等[６]以HPLC法测定了大豆中13种三嗪类农药残留。由于地克珠利和妥曲珠利在紫外吸收光谱上的差异，目前尚未见同时分析动物组织中地克珠利与妥曲珠利药物残留的报道。

    基质固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)由Barker等[7]提出并给予理论解释的一种样品处理技术。MSPD将常规的固相分散技术与反相键合填料相结合，组织匀浆、提取和净化在同一操作中完成，分析环节大为减少、操作简化。本研究以MSPD为基础，建立了地克珠利和妥曲珠利的多残留快速分析技术，并对MSPD样品处理过程和液相色谱分离条件进行了优化。

2、实验部分

　　2.1  仪器与试剂

    HP1100液相色谱仪（美国Agilent公司），配低压四元泵、脱气泵、紫外检测器、自动进样器和柱温箱；Symmtry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm i.d.， 5 μm，美国 Waters公司）； 12孔固相萃取装置（美国Supelco公司）；AM- 6组织匀浆机 ( 株式会社日本精机制作所，北京慧宇诚越科技发展有限公司)；RE52AA旋转蒸发仪 (上海亚荣生化有限公司)；D37520冷冻离心机（德国Osterode am Harz 公司）。C18填料（粒径40 μm，美国Alltech公司）；地克珠利(99.7%)、妥曲珠利(99.8%)（美国Sigma公司)；乙腈、甲醇和四氢呋喃(色谱纯，美国Fisher公司)；其它试剂均为分析纯；Millipore 18.2 MΩ cm高纯水。

2.2  实验方法

　　2.2.1  填料和标准溶液制备 

　　C18填料预处理： 22 g C18填料，装入50 mL玻璃注射器，依次用2倍柱体积的正己烷、二氯甲烷和甲醇洗涤，真空干燥，贮于磨口玻璃干燥器内备用。混合标准溶液配置：准确称取地克珠利和妥曲珠利标准品各10.0 mg，置100 mL容量瓶中，用25 mL四氢呋喃溶解后，用60%乙腈水溶液定容，摇匀，2～8℃避光存放；使用时用60%乙腈水溶液稀释至所需浓度。

　　2.2.2  色谱条件 

　　分析柱：C18(250 mm×4.6 mm i.d. 5 μm, 美国 Waters公司)；流动相：0.05 mol/L H3PO4三乙胺(pH3.0)乙腈(40+60)，流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm，AUFS =0.05；进样体积：20 μL；柱温：20℃。

　　2.2.3  样品采集 

　　健康AA肉鸡，饲喂全价不含抗球虫药物日粮。10 d后，采集肝脏、肾脏、肌肉样品，置于－20℃冰箱保存备用。

　　2.2.4  洗脱溶剂的选择 

　　2.0 g C18填料和一定量混合标准溶液在研钵中用研杵沿同一方向轻轻研匀。混合物放置在通风柜内0.5 h后， 转入层析柱中，并用注射器活塞轻轻压实。用15 mL正己烷分3次淋洗，分别收集淋洗液，过0.22 μm滤膜后进行液相色谱分析。分别用甲醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、超纯水作为洗脱剂重复上述实验步骤。每个实验平行3次。

　　2.2.5  基体固相分散提取条件的选择 

　　预混有1 mL地克珠利和妥曲珠利混合标准溶液的0.5 g鸡组织匀浆与2 g C18填料在研钵中研匀。上述样品混合物在通风柜中放置 2～5 min后转入层析柱。层析柱自下而上依次装入玻璃棉、1.5 g无水Na2SO4、样品混合物、0.5 g无水Na2SO4，压紧。分别用16 mL 淋洗液淋洗，8 mL 洗脱液洗脱，收集洗脱液，50℃旋转蒸发至干，用0.5 mL流动相溶解残渣，过0.22 μm滤膜后作为试样溶液，然后取20 μL注入HPLC进行检测。 每处理重复3次，同时设空白对照。为考察C18填料与样品比例、淋洗剂种类与组合、洗脱剂种类与用量对添加回收结果的影响，采用正交实验设计，按L9（34）设计表（见表1）进行。表1  因素水平表（略）

3 、结果与分析

　　3.1  检测波长与色谱分离条件的确定

    文献记载地克珠利均采用280 nm，而妥曲珠利采用240 nm作为紫外检测波长[8～10]。为获得较理想的分析条件，采用紫外分光光度计分别对地克珠利和妥曲珠利进行紫外光谱扫描，结果显示地克珠利除280 nm处有一吸收峰外，在200～250 nm也有紫外吸收，且其在240 nm处的紫外吸收与妥曲珠利的吸收值相近，故本实验选择240 nm作为检测波长。

    实验比较了乙酸铵∶乙腈、乙酸三乙胺∶乙腈、磷酸盐缓冲液∶乙腈和H3PO4三乙胺∶乙腈４种流动相体系对地克珠利和妥曲珠利的分离效果。结果表明，在H3PO4三乙胺∶乙腈体系中地克珠利和妥曲珠利在较短的时间内分离效果，且柱压较低。在本实验选择的0.05 mol/L H3PO4三乙胺(pH 3.0)乙腈(40+60)为流动相的条件下，地克珠利和妥曲珠利在12 min内获得基线分离。

　　3.2 定量标准曲线

    用60%乙腈水溶液将混合储备标准液稀释为 50、100、200、500、1000 ng/mL的系列工作标准液，进行液相色谱分析。每个浓度点重复测定4次，取平均值绘制色谱峰面积浓度标准曲线，得地克珠利和妥曲珠利药物标准曲线。地克珠利：CDIC=21.11SDIC–32.76， r＝0.9998；妥曲珠利：CTOL=23.56STOL–21.65，r＝0.9995。C为药物浓度（ng/mL），S为色谱峰面积（mAu s）。

　　3.3 MSPD条件的优化

　　3.3.1  洗脱溶剂的选择 

　　研究了正己烷、甲醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯和水对地克珠利和妥曲珠利的洗脱能力（见表2）。由表2数据可知：正己烷和水对地克珠利和妥曲珠利无洗脱能力，只能洗掉C18柱上结合力很小的一些杂质，适于作淋洗液；二氯甲烷与乙酸乙酯可洗脱部分地克珠利和妥曲珠利，但洗脱能力较弱不适于作为洗脱剂；甲醇和乙腈的洗脱能力强，在较少体积即可达到满意的回收率。表2  不同溶剂的洗脱回收率（略）

　　3.3.2  正交试验结果 

　　为减少动物组织中复杂基质成分对紫外检测的影响，本实验采用两步洗脱法，先用淋洗液对样品进行清洗净化，再使用洗脱剂进行洗脱。按L9（34）设计进行了不同的淋洗液的净化效果和洗脱剂的洗脱能力研究。研究结果列于表3和表4。

    实验结果表明，填料用量、洗脱剂种类和用量3种因素对回收率影响较大，达到*回收的因素水平分别为： 2、3、3、3（地克珠利）和2、2、3、3（妥曲珠利）。尽管适用二者的淋洗液组成有一定差异，但考虑到使用8 mL 正己烷+8 mL 甲醇水溶液（1∶4, V/V）较8 mL正己烷+8 mL水淋洗生成的色谱图要干净一些，且淋洗液组成在各因素中对回收率的影响zui小，所以本实验采用了2、3、3、3的组合作为优化后的样品前处理方法。混有一定量混合标准液的0.5 g鸡组织样品加到研钵中的 2 g Cl8填料上，研匀，在通风柜中放置2～5 min后，将混合样品转入层析柱中。层析柱自下而上依次装入玻璃棉、1.5 g无水Na2SO4、样品混合物、0.5 g无水Na2SO4，压紧。分别用8 mL正己烷、8 mL甲醇水溶液（1∶4, V/V）淋洗，然后用8 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，50℃旋转蒸发至干，用0.5 mL流动相溶解残渣，过0.22 μm滤膜后作为试样溶液，然后取20 μL 注入HPLC进行检测。表3  正交试验结果（略）表4  地克珠利与妥曲珠利回收率的极差（略）

　　3.4  标准加入的回收率

    称2 g C18填料置玻璃研钵中，将0.5 g 剁碎的鸡组织样品加到研钵中的C１8填料上，添加1 mL混合标准品溶液（25、250和500 μg/L），使组织中的标准品浓度分别相当于50、500和1000 ng/g，研匀，按优化后的方法处理。取处理后的样品液，用HPLC法测定，按外标法以峰面积计算，测定药物浓度，计算公式为：X=A样C对V/A对M式中: X为试料中DIC、TOL的残留量(ng/g)；A样为试样溶液中相应珠利的峰面积；A对 为对照溶液中相应珠利的峰面积；C对 为对照溶液中相应珠利的浓度(μg/L)；V为试样溶液体积(mL)；M为供试试料的质量(g)。以测定结果与实际添加药物浓度的比值计算样品添加回收率。由表5中结果可以看出地克珠利和妥曲珠利在3种组织样品中的回收率均大于70%，符合残留检测要求。表5  地克珠利、妥曲珠利在鸡组织中提取回收率(略)

　　3.5  精密度(相对标准差)

    取含有地克珠利和妥曲珠利高、中、低(50、100和1000 ng/g) 3种浓度的肌肉组织样品各3份，按优化后的方法处理后测定。分别于同日内5个不同时间点及3个不同日内重复制样测定，计算日内变异和日间变异。由表6可知地克珠利和妥曲珠利的日内、日间变异系数均低于15%，符合残留分析对精密度的要求。表6  地克珠利和妥曲珠利的测定精密度（略）

　　3.6  检出限与定量下限

    取空白的肌肉、肝脏、肾脏样品，10个平行，按上述样品前处理的方法处理，测得基线噪音值B0，以B0+3SD为检出限(LOD), B0+10 SD为定量限(LOQ )。地克珠利的检出限分别为8 ng/g（肌肉）和10 ng/g（肝、肾）；定量限分别为12 ng/g（肌肉）和15 ng/g（肝、肾）。妥曲珠利的检出限分别为7 ng/g（肌肉）和10 ng/g（肝、肾）；定量下限分别为10 ng/g（肌肉）和15 ng/g（肝、肾）。结果表明，本方法在准确度、精密度上均达到了残留分析的要求。