准确、快速、自动化顶空气相色谱法测定人体血液中挥发物
时间：2024-10-24 阅读：123
本应用介绍了使用配备双色谱柱、双火焰离子化检测器 (FID) 和顶空进样器的GC2400气相色谱仪对血醇浓度 (Blood alcohol concentration，BAC) 以及生物样品中血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、异丙醇和正丁醇的测定，完美应对公安部标准GA/T842-2019以及国家标准GB/T 42430-2023。
结果证明本系统具有准确、快速、自动化程度高等性能，在预期浓度范围内表现了良好的线性以及重复性。本方法采用双孔石墨垫将两根色谱柱（Elite-BAC1和Elite-BAC2）安装在一个进样口上无死体积同时分离样品组分，大大提高了分析效率。该方法在10~400 mg/100mL浓度范围内线性良好，相关系数R2均大于等于0.9995以上，方法重现性RSD均小于2%，方法的检出限为0.5 mg/100mL。
BAC是什么？
BAC指的是血流中乙醇的百分比，可通过血液、尿液或呼气测试来测定。气相色谱BAC分析在法律、法医和诊断场景中是一种成熟的测试方法，血液是一种极其复杂的混合物，大部分是非挥发性物质。这对传统气相色谱方法中直接注射全血样品提出了重大挑战。本方法采用珀金埃尔默顶空专利的压力平衡时间进样技术，以高灵敏度，高重现性，极低残留的优异数据以及灵活更改进样体积等操作简单，维护方便，全自动控制的特性与珀金埃尔默全新的GC2400气相色谱以及全新智能软件平台--SimplicityChrom CDS色谱工作站构成了完美一体化的GC系统，更加适用于血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、异丙醇和正丁醇等样品分析。尤其是优异的重现性和极低的残留，既保证了结果的准确，还减少了非必要的连续进空白样品确认是否有残留并减少了准备的时间。
本文参照公安GA/T842-2019标准以及国家标准GB/T 42430-2023，以叔丁醇为内标，顶空-气相色谱法分析生物样品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、异丙醇和正丁醇含量，该方法准确可靠，重复性好。
1、实验条件
GC2400气相色谱仪配置分流/不分流进样口 (CAP) 和双FID，采用顶空专利的压力平衡时间进样技术进样（如图1）。采用双孔石墨垫将两根色谱柱（Elite-BAC1和Elite-BAC2）安装在一个进样口上以在双柱和双FID配置中运行分析，图2显示了此配置的示意图。
图 1 压力平衡时间进样技术示意（点击查看大图）
图 2 采用双柱和双FID进行分析（点击查看大图）
2、仪器参数 1
（应对公安部GA/T842-2019标准）
表1和表2列出了本应用中参照公安部GA/T842-2019血液酒精含量的检测方法使用的顶空进样器和气相色谱仪的方法参数。
表1顶空进样器参数
表2气相色谱参数
3、标样及样品制备 1
1样品制备
取待测全血0.1 ml及叔丁醇内标工作溶液0.5 ml（4 mg/100ml）加入样品瓶内，用密封钳加封带PTFE涂层的硅橡胶铝盖，混匀，待测。
2标准制备
配置系列浓度的乙醇标准工作液，浓度分别为10 mg/100ml、20 mg/100ml、50 mg/100ml、80 mg/100ml、100mg/100ml、150 mg/100ml、180 mg/100ml、200 mg/100ml、300 mg/100ml、400 mg/100ml。取系列浓度的各标准溶液0.1 ml和叔丁醇内标溶液0.5 ml，分别加入样品瓶内用压盖器加封带PTFE涂层的硅橡胶铝盖，混匀，待测。为确定重复性，乙醇标样 (n = 7) 浓度配制为20 mg/100ml和80 mg/100ml，内标为浓度4 mg/100ml。
此外，样品及标样的制备亦可采用珀金埃尔默自动化解决方案 *，无需人工干预，实现样品的自动处理和准备，无人值守即可完成随到随检，应对样品检测较高的时间随机性挑战；同时有效减少实验人员的直接接触，降低了传染病传播潜在风险。
* 详见文末介绍
4、参考谱图、校准曲线 1
在Elite-BAC1和Elite-BAC2色谱柱上进行校准，采用双柱双FID配置进行校准。每个浓度重复进样（n=3）。图3和图4分别是在的Elite-BAC1和Elite-BAC2色谱柱上得到的谱图，图5和图6分别是在的Elite-BAC1和Elite-BAC2色谱柱上得到的校准曲线。
图3 Elite-BAC1（点击查看大图）
图4 Elite-BAC2（点击查看大图）
图5 Elite-BAC1 y = 0.475944 x - 0.0191172 R² = 0.999911（点击查看大图）
图6 Elite-BAC2 y = 0.493561 x - 0.0209635 R² = 0.999932（点击查看大图）
5、重现性及检出限 1
分别在20mg/100ml和80mg/100ml下测定峰面积重复性和检出限(表3)。表3显示每种浓度及双色谱柱RSD均小于2%。图7展示了进样高浓度乙醇后的空白样品中没有任何残留，面对复杂和可能出现高含量未知样品，优异的无样品交叉污染和无残留也是珀金埃尔默顶空进样器的一大特点。
表3 20 mg/100ml和80 mg/100ml的7次进样的相对标准偏差(RSD%)
图7 顶空残留测试结果（点击查看大图）
6、仪器参数2
（应对标准GB/T 42430-2023）
表4和表5列出了本应用中参照国标GB/T 42430-2023血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、异丙醇和正丁醇检测方法使用的顶空进样器和气相色谱仪的方法参数。
表4顶空进样器参数
表5气相色谱参数
7、标样及样品制备 2
1样品制备
取待测全血0.1 ml及叔丁醇内标工作溶液0.5 ml（4mg/100ml）加入样品瓶内，用密封钳加封带PTFE涂层的硅橡胶铝盖，混匀，待测。
2标准制备
配置系列浓度的乙醇标准工作液，浓度分别为10 mg/100ml、20 mg/100ml、50 mg/100ml、100 mg/100ml、300 mg/100ml。取系列浓度的各标准溶液0.1 ml和叔丁醇内标溶液0.5 ml，分别加入样品瓶内用压盖器加封带PTFE涂层的硅橡胶铝盖，混匀，待测。为确定重复性，乙醇标样(n = 7) 浓度配制为80 mg/100ml，内标为浓度4 mg/100ml。
此外，样品及标样的制备亦可采用珀金埃尔默自动化解决方案 *，无需人工干预，实现样品的自动处理和准备，无人值守即可完成随到随检，应对样品检测较高的时间随机性挑战；同时有效减少实验人员的直接接触，降低了传染病传播潜在风险。
* 详见文末介绍
8、参考谱图、校准曲线2
图8 Elite-BAC1（点击查看大图）
图9 Elite-BAC2（点击查看大图）
图10 Elite-BAC2甲醇y = 0.24054 x - 0.0140911 R² = 0.999933（点击查看大图）
图11 Elite-BAC2乙醇y = 0.4745 x - 0.0336552 R² = 0.999931（点击查看大图）
图12 Elite-BAC2丙酮y = 1.7793 x - 0.093784 R² = 0.999959（点击查看大图）
图13 Elite-BAC2异丙醇y = 0.877878 x - 0.0636693 R² = 0.999852（点击查看大图）
图14 Elite-BAC2正丙醇y = 0.829151 x - 0.0708528 R² = 0.999824（点击查看大图）
图15 Elite-BAC2正丁醇y = 1.07171 x - 0.0989462 R² = 0.999863（点击查看大图）
9、重现性 2
在80 mg/100ml下测定峰面积重复性（表6）。表6显示每种浓度及双色谱柱RSD均小于2%。
表6 80 mg/100ml的7次进样的相对标准偏差(RSD%)
结论
本方法根据公安部标准GA/T842-2019以及国家标准GB/T 42430-2023的步骤，结合全新的珀金埃尔默顶空专利的压力平衡时间进样技术和GC2400气相色谱仪平台，对生物样品中血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、异丙醇和正丁醇进行检测，且经过验证，该方法简便、快速、准确，可供各级公安部门及司法鉴定中心参考。
珀金埃尔默自动化样品制备解决方案
在现代实验室中，自动化样品制备扮演着至关重要的角色，为实验数据的准确性和一致性提供了坚实保障。自动化流程的实施不仅打破工作时间的局限性，提高实验室实时效率，更重要的是降低了潜在的健康危害风险，实现了实验室安全与高效的完美结合。
珀金埃尔默自动化样品制备解决方案轻松应对应对公安部标准GA/T842-2019以及国家标准GB/T 42430-2023中样品的前处理、制备过程，并充分发挥自动化样品制备的特点。
自动化样品制备在样品处理过程中的每一个环节都能够保持高度准确性和一致性，减少了人为操作误差的可能性，确保了实验数据的可靠性，客观性。不论是小样品处理还是高通量样品处理，自动化流程都能够保证每一个样品的处理都严格按照设定的程序进行，从而消除了人为因素对实验结果的影响。
针对血液中酒精含量的测试，各类鉴定机构都面临着来样随机性和检测结果实时性等挑战。珀金埃尔默自动化样品制备解决方案通过不同模块的灵活组合，实现了24*7无人值守操作，通过机器人将样品制备及分析测试无缝衔接，从样品处理到报告出具一气呵成。配备远程监控功能，可以通过远程访问监控实验进程和结果，及时掌握样品处理情况，实现真正的无人值守操作。此外，该系统可与数据管理系统集成，在保证数据的准确性和可追溯性的同时，大大提高实验结果的时效性。
自动化样品制备设备的应用，将实验中的样品处理环节自动化，减少了实验人员直接接触样品所带来的健康危害风险，保障了实验室工作者的健康与安全。
Figure 1
样品信息识别与绑定
通过扫码对样品信息进行识别，并确保样品与数据结果有序对应。
Figure 2
自动化开关盖
为样品转移做准备，可对不同类型、规格的样品瓶进行自动化开关盖操作。
Figure 3
a & b
自动化样品处理
采用一次性移液枪头将指定体积的液体样品进行转移，防止样品交叉污染。在此过程中，可升级如涡旋振荡，加热，离心等功能模块。
Figure 4
自动化压盖
实现顶空瓶的自动化压盖操作过程，以及压盖过程中垫片、瓶盖的自动化补给，降低人工维护频次。
Figure 5
智能上样机器人
将样品瓶转移至顶空自动进样器中，并触发分析仪器进行分析。通过智能排程规划，实现一对多的应用场景。同时可升级移动机器人，扩大实验室自动化生态圈。
参考文献
1.Boswell, H. A.; Dorman, F. L. Uncertainty of Blood Alcohol Concentration (BAC) Results as Related to Instrumental Conditions: Optimization and Robustness of BAC Analysis Headspace Parameters. Chromatography 2015, 2, 691–708