奶粉中的维生素A、D3、E的测定（固相萃取-液相色谱法）
时间：2015-07-05 阅读：7255
目前对奶粉中脂溶性维生素A、D3、E测定的前处理方法多采用皂化方法去除脂肪[1-7]，皂化过程后使用大量的有机溶剂进行液液萃取以洗除杂质，操作步骤复杂，维生素D3样品还需经硅胶柱做进一步的净化才能进行检测，造成实验时间成本的增加，不利于大批量样品的检测。本文研究了利用固相萃取法作为奶粉样品的前处理方法，液相色谱法作为检测手段，实现同时测定奶粉中维生素A、D3、E的含量，该方法可简化奶粉样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。
1. 样品处理
皂化提取：2g奶粉加入1mL水混匀，加入1 mL VC/乙醇溶液破壁处理，混匀，加入10mL氢氧化钾碱液（1.25g/mL），55℃条件下，水浴皂化45min，取出冷却至室温，向皂化液中加入适量无水乙醇，使之含50%乙醇，6000r/min离心5min后，取上清液，用1至2个微孔过滤器对其进行过滤，至Qdaura 卓睿™全自动固相萃取仪上样管中作为待净化液。
2. 固相萃取净化
QdauraTM卓睿全自动固相萃取仪程序设定：5mL甲醇，和5mL水活化，加样，10mL50%乙醇/水淋洗，抽干20min。2mL 丙酮，10mL乙酸乙酯洗脱，收集。收集液于40℃氮气吹干，1mL甲醇定容，0.45um PTFE过滤器过滤，准备进液相色谱分析。
3. 色谱条件
液相色谱仪：LC-10F
色谱柱：Venusil MP C18，4.6 mm *150 mm，5µm；
流动相：甲醇；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20µL；
波长变化见表1：
表1 波长变化梯度表
组分 | 时间/min | 波长/nm |
维生素A | 0 | 325 |
维生素D3 | 5 | 264 |
维生素E | 9 | 294 |
4. 结果与讨论
图1 低浓度维生素标准溶液的色谱图
从左至右依次为：维生素A（5.0µg/mL）、维生素D3（9.8µg/mL）、维生素E（99µg/mL）
4.1 工作曲线及检出限
根据仪器对各个物质的响应情况，将维生素A、D3、E分别由储备液用正己烷逐级稀释，各稀释成7个浓度，维生素A浓度范围为0.25µg/mL~25µg/mL，维生素D3浓度范围为0.30µg/mL~30µg/mL，维生素E浓度范围为2.5µg/mL~250µg/mL，将溶液进HPLC进行检测，计算出检出限，回归方程及检出限见表2。可见，液相色谱仪对维生素A、D3、E的响应与浓度呈良好的线性关系。
表2 线性回归方程及检出限
化合物 | 回归方程 | 相关系数 | 检出限 LOD* （µg/mL） |
维生素A | y=55.572*x-1.517 | 1 | 0.02 |
维生素D3 | y=57.608*x-1.9814 | 1 | 0.05 |
维生素E | y=8.1342*x-1.9094 | 1 | 0.39 |
图2 皂化-固相萃取法色谱图
4.2 皂化-固相萃取和传统皂化-液液萃取法的实验效果对比
传统皂化-液液萃取法参考《GB 5413.9—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E 的测定》的样品前处理2个奶粉（每个样称取2g）的平行样，作为参照。同时以皂化固相萃取法做两个平行样品。
表3 传统皂化-液液萃取法与皂化固相萃取法的实验结果对比
维生素A峰面积 | 维生素D峰面积 | 维生素E峰面积 | |
传统皂化-液液萃取法 | 778 | 0 | 148 |
皂化固相萃取法 | 1500 | 0 | 716 |
由于选用的奶粉VD含量较低，没有检出。
从上述对比可以看出，皂化固相萃取法相比国标的皂化液液萃取法具有简单的优势，同时萃取效果更好。*的缺点是出峰靠前的维生素A附近有较多的弱保留物质的干扰，但是依靠MP C18的强大的分离能力，可以实现分离维生素A和干扰物质的基线分离。同时这些弱保留的物质很容易被洗脱出色谱柱，所以不会对色谱柱造成较大的污染。
4.2.3加标回收率实验
表4 加标回收率及精密度
化合物 | 样1（%） | 样2（%） | 样3（%） | 样4（%） | 样5（%） | 平均回收率% | RSD（%，n=5） | |
低浓度 加标 | 维生素A | 89.91 | 91.48 | 86.12 | 89.59 | 90.12 | 89.44 | 2.33 |
维生D3 | 112.36 | 114.63 | 106.34 | 111.63 | 105.35 | 110.06 | 3.83 | |
维生素E | 85.58 | 86.87 | 81.83 | 85.64 | 84.56 | 84.90 | 2.86 | |
高浓度 加标 | 维生素A | 88.84 | 91.48 | 89.61 | 86.43 | 89.57 | 89.18 | 2.04 |
维生D3 | 93.06 | 94.65 | 93.19 | 90.38 | 92.86 | 92.83 | 1.66 | |
维生素E | 86.68 | 87.62 | 87.00 | 83.25 | 85.94 | 86.10 | 1.98 |
4.2.3 实际样品检测
根据所建立的方法分析了从市场上购买的3种品牌奶粉，分别编号为1号、2号和3号按照上述方法进行样品处理和检测，所得维生素A、D3和E的含量结果见表6。
图7. 2号奶粉样品色谱图
表6 奶粉中维生素含量（µg/g）
化合物 | 1号 （µg/g） | 2号 （µg/g） | 3号 （µg/g） |
维生素A | 6.008 | 42.5 | 165.0 |
维生素D3 | 0.392 | 0.000 | 0.463 |
维生素E | 5.712 | 6.231 | 9.344 |
4.3 结论
采用改进后的皂化-固相萃取方法来替代传统的皂化法来测定奶粉中维生素含量，皂化能充分提取出奶粉中维生素A，D，E，再经过Cleanert Vitamin固相萃取柱进行净化吸附洗脱，既避免了传统皂化中液液萃取中有机溶剂的大量使用，也简化了操作步骤，同时能满足一般奶粉样品的含量分析要求。
5.订货信息
产品名称 | 规格包装 | 订货号 |
LC-10F液相色谱仪 | 10ml/min，梯度系统，200-800nm双波长检测器 | FL-LC010GS |
LC-10F液相色谱仪 | 配紫外可变波长检测器 | LC-10F |
CC-100分析型色谱柱温箱 | 温控范围：5-70℃； 可安装1-2支300mm色谱柱 | CC-100 |
Qdaura 卓睿™全自动固相萃取仪 | 4通道24位 | SPE-40 |
Cleanert Vitamin脂溶性维生素萃取柱 | 1g/12mL , 20支/pk | V00012(报价：1360元/盒） |
Venusil MP C18液相色谱柱 | 4.6 mm x150 mm，5µm | V952505-0 |
微孔过滤膜（PTFE疏水）-双膜 | 045µm,直径13mm,100/pk | AS041345-P |
微孔过滤膜（PVDF亲水）-双膜 | 0.45µm,直径13mm,100/pk | AS073345-G |
一次性无菌注射器 | 5mL, 100/pk | ZSQ-5ML |
1.5mL样品瓶 | 100/pk | 1109-0519 |
1.5mL样品瓶盖 | 100/pk | 0915-1819 |
甲醇 | 4×4L/瓶 | AH230-4 |
乙醇 | 4×4L/箱 | AH090-4 |
乙酸乙酯 | 4×4L/箱 | AH100-4 |
正己烷 | 4×4L/箱 | AH216-4 |