Emfret Analytics GmbH（成立于 2002 年）专注于生物医学研究（即血管生物学）中单克隆抗体的生产、表征、衍生化和供应。

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免疫组化（用丙酮固定的冰冻切片）

请注意：不建议对（对）甲醛固定的样品进行免疫染色，因为在这些条件下，大多数大鼠抗体在小鼠组织上只能产生较差的结果。

1. 将冷冻组织的切片安装在载玻片上，并在 4°C 的冰冷 100% 丙酮中固定 20 分钟。在室温下干燥样品过夜。

2. 为了尽量减少试剂体积，可以用防水笔在载玻片上的组织部分周围画一个疏水环。在接下来的所有程序中，这个被包围的区域不应干涸。因此，建议在潮湿的盒子中进行孵化步骤。

3. 在 PBS 中孵育幻灯片 20 分钟。

4. 当使用过氧化物酶偶联的二抗时，在室温下用 0.03% H2O2 孵育载玻片 10 分钟以抑制内源性过氧化物酶活性。在 PBS 中冲洗载玻片 3 次，每次 5 分钟。

5. 将玻片在室温下在封闭溶液（来自待使用的二抗宿主物种的血清）中孵育 1 小时，在 PBS 中稀释 1:10 或 1:100。

6. 用封闭溶液中的一抗 (2-10 µg/ml) 覆盖载玻片，并在室温下孵育 2 小时。

7. 从载玻片上吸干多余的液体，并在 PBS 中冲洗 3 次，每次冲洗 5 分钟。

8. 根据制造商的说明，用在封闭溶液中稀释的荧光团或过氧化物酶偶联的二抗（例如亲和纯化的驴抗大鼠 IgG-FITC 或 -HRP，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）覆盖载玻片。在 RT 中孵育 1 小时。

9. 从载玻片上吸干多余的液体，并在 PBS 中冲洗 3 次，每次冲洗 5 分钟。

10. a) 荧光染色的样品可以通过荧光显微镜直接分析。

11. b) 为了观察过氧化物酶标记的结构，用新鲜制备的 3-氨基-9-乙基咔唑 (AEC) 底物盖住载玻片并孵育直至在显微镜下可见红色染色，时间可在 5 到 30 分钟之间变化。在橙色背景染色发生之前用去离子水冲洗停止反应。对于复染，用苏木精孵育样品 30-240 秒，并用流动的温水冲洗载玻片 20 分钟。使用包埋水溶液（例如 Aquatex、Merck）安装切片。

    
    

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