先前研究发现，黄芩苷能够通过调节NLRP3磷酸化抑制NLRP3介导的细胞焦亡，因此，研究者希望进一步了解黄芩苷对泛凋亡的抑制机制。研究者接着探讨黄芩苷对泛凋亡细胞死亡的抑制作用是否依赖于NLRP3或Caspase-1的表达。具体实验思路如下：

1.实验设计：

使用两种类型的巨噬细胞：野生型（WT）BMDMs和基因敲除（Nlrp3-/-和Casp1-/-）BMDMs。

采用OXO和TNF-α组合处理这些细胞，以诱导泛凋亡的发生。使用PI染色法检测细胞裂解性死亡，比较在不同细胞类型中，黄芩苷的抑制效果。

2. 结果分析：

无论是使用Nlrp3-/-细胞还是Casp1-/-细胞，OXO+TNF-α诱导的裂解性细胞死亡水平均相似，这表明泛凋亡的激活与NLRP3或CASP1的表达无关。

进一步结果显示，黄芩苷在两种细胞中均显示出相似的抑制作用。

结论：上述结果表明OXO+TNF-α诱导的泛凋亡并不依赖于NLRP3或Caspase-1，因此，黄芩苷对泛凋亡的抑制作用可能是通过非NLRP3/CASP1相关的其他信号通路实现的。本实验展示黄芩苷的抑制机制不依赖于NLRP3或Caspase-1，为后续探索其具体作用机制提供了方向。

图2 黄芩苷抑制作用不依赖于NLRP3或CASP1（图源[1]）

PANoptosome组装涉及ASC（细胞焦亡信号成分）、CASP8（细胞凋亡信号成分）、RIPK1、RIPK3、MLKL（坏死性凋亡信号成分）和ZBP1。研究目的是确认黄芩苷是否能影响PANoptosome的组装。

研究者探讨了黄芩苷对ZBP1相关PANoptosome组装的影响。PANoptosome是突触细胞死亡信号的关键分子平台，通过整合细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡的信号来激活泛凋亡。具体实验思路如下：

1.实验方法：

未处理的细胞或处理TNF-α的细胞作为对照，免疫荧光显微镜观察核心组分（MLKL、CASP8、ASC、RIPK3、RIPK1、ZBP1）在基线状态下的分布情况。

使用OXO+TNF-α处理诱导泛凋亡，观察这些蛋白在死亡细胞中的聚集行为，特别是ASC的斑点与其他信号通路成分的共定位。评估黄芩苷预处理对这些信号成分聚集和共定位的影响。

使用免疫共沉淀实验验证ASC、RIPK3、ZBP1和CASP8之间的相互作用。但在实施时，考虑到PANoptosome可能在Co-IP裂解缓冲液中不溶，转而分别分析可溶和不可溶部分。

通过Western blot分析可溶性的ZBP1、RIPK1、RIPK3、MLKL、CASP8、NLRP3和ASC的水平。在OXO+TNF-α处理后，可溶组分中这些蛋白显著降低，而不溶组分中则显著增加。

2. 结果分析：

在OXO+TNF-α处理下，观察到关键成分的聚集与共定位，尤其是ASC、ZBP1、RIPK3的共定位现象，表明PANoptosome的组装。

黄芩苷预处理显著抑制了这些蛋白的聚集和共定位，说明黄芩苷能有效阻断PANoptosome的形成。黄芩苷预处理后，抵消了OXO+TNF-α诱导的这些信号成分从可溶相向不可溶相的募集，进一步验证了PANoptosome的组装受阻。

结合免疫荧光显微镜的观察，结果得出黄芩苷确实有效阻断了PANoptosome的组装。

综上，本实验表明黄芩苷通过抑制PANoptosome的组装，从而影响泛凋亡的激活。这为深入理解黄芩苷在调节细胞死亡信号中的作用提供了重要依据。

图 3黄芩苷抑制PANoptosome 形成（图源[1]）

线粒体在调节多种细胞死亡机制中扮演重要角色，特别是在细胞凋亡和泛凋亡中，线粒体的功能和健康状态对细胞命运有重大影响。本实验旨在探讨线粒体损伤与泛凋亡的关系，以及黄芩苷的保护作用。研究者探索了线粒体在诱导泛凋亡中的作用，并评估了黄芩苷在这一过程中所起的保护作用。具体实验思路如下：

1.线粒体膜电位（MMP）的测定：

使用TMRE探针检测线粒体膜电位。当细胞内MMP正常时，TMRE染料积累在线粒体，并发出红色荧光；当MMP受损时，TMRE的荧光强度会降低。

使用JC-1染料检测相同参数。在正常情况下，JC-1形成聚集体显红色，当MMP降低时，JC-1转为单体并扩散至细胞质显绿色。

2. ROS的检测：

用DCFH-DA探针检测细胞内总ROS水平，观察到在OXO+TNF-α或OXO+LPS处理后，总ROS显著上升，黄芩苷处理则有效抑制了这一上升。

使用MitoSOX探针检测线粒体内ROS水平，实验结果显示OXO+TNF-α或OXO+LPS处理后mtROS显著增加，而黄芩苷也能够抑制mtROS的产生。

在细胞核中观察到强烈的MitoSOX荧光，可能与线粒体受损导致的细胞膜透化有关。

3. 结果分析：

图 4黄芩苷可减轻线粒体损伤（图源[1]）

研究者旨在探讨线粒体源性活性氧（mtROS）与泛凋亡之间的因果关系，并阐明黄芩苷如何通过影响mtROS的生成及氧化态mtDNA（Ox-mtDNA）的形成来抑制泛凋亡。具体实验思路如下：

1. 确认因果关系：

mtROS的清除与促进：使用线粒体靶向清除剂mito-TEMPO来抑制mtROS，提高对OXO+TNF-α诱导的泛凋亡细胞死亡的抑制效果。同时，使用kang霉素A(AA)促进mtROS的生成，观察其对黄芩苷抑制细胞死亡的影响。

通过PI染色定量细胞存活，结果表明mito-TEMPO通过剂量依赖减少泛凋亡，而AA则加重细胞死亡，从而确认mtROS在泛凋亡中的因果作用。

2. Ox-mtDNA的角色：

细胞内氧化态DNA的观察：使用免疫荧光显微镜明确显示OXO+TNF-α诱导后形成的氧化态mtDNA（使用8-OHdG抗体）与线粒体特定标记Tom20的共定位，表明Ox-mtDNA参与PANoptosome的组装。

ASC speck的共定位：证明Ox-mtDNA与PANoptosome的组装相关，且黄芩苷能够抑制Ox-mtDNA的形成及PANoptosome的组装。

3. mtDNA的释放机制：

线粒体通透性转换孔(mPTP)和电压依赖性阴离子通道(VDAC)的作用：探讨mtDNA通过mPTP和VDAC通道的释放，使用环孢素A(CsA)和VBIT-4作为抑制剂，观察其对OXO+TNF-α诱导的细胞死亡的影响，结果显示显著减弱细胞死亡。

mtDNA释放的检测：使用Triton X-100处理细胞，分离不溶性组分DNA并进行qPCR分析，结果显示泛凋亡诱导后mtDNA显著增加，CsA和VBIT-4的联合处理可阻止这种增加。

4. 黄芩苷的作用机制：

mtDNA的阻断：黄芩苷预处理有效减少不溶性组分中的mtDNA，指示其可能干扰mPTP和VDAC通道的开放。

VDAC寡聚体水平的Western blotting：显示黄芩苷和VBIT-4均能降低由泛凋亡诱导剂引起的VDAC寡聚体的水平，进一步支持黄芩苷通过影响这些通道来抑制mtDNA释放和泛凋亡。

综上所述，该实验通过证明mtROS与Ox-mtDNA在泛凋亡过程中的重要作用，阐明了黄芩苷作用的潜在机制，为黄芩苷抗泛凋亡的药理作用提供了科学依据。这为理解线粒体功能丧失在细胞死亡调节中的角色以及药物干预提供了理论基础。

图 5黄芩苷阻断mtDNA的氧化和释放抑制 PANoptosis（图源[1]）

本段实验通过去除线粒体DNA（mtDNA）进一步验证mtDNA在泛凋亡中的作用，具体思路如下：

1. mtDNA的去除：

使用溴化乙锭（EB）：EB被用作线粒体靶向染料，能够有效嵌入 mtDNA 中并在处理后去除线粒体DNA。通过这一处理，研究者希望评估缺失mtDNA对细胞状态及其对泛凋亡的影响。

2. 线粒体质量的评估：

线粒体质量的检测：实验结果显示，EB处理后，细胞内线粒体质量（ρ0）显著降低，表明mtDNA的去除对线粒体的完整性产生了明显影响（如图4g,h所示）。

3. 细胞存活的测试：

PI染色分析细胞死亡：在OXO+TNF-α诱导下，观察到EB处理的细胞中细胞死亡显著抑制。与未处理细胞相比，缺失mtDNA的细胞展现出更好的生存率（如图4i所示）。

4. 结果分析：

实验结果表明，线粒体DNA的存在与OXO+TNF-α诱导泛凋亡之间存在关系。EB处理减弱了mtDNA的功能，从而导致细胞对诱导的死亡信号表现出更强的抵抗力。这些数据进一步支持了mtDNA在泛凋亡中的作用，尤其是Ox-mtDNA的氧化和释放对于PANoptosome的组装至关重要。通过保护线粒体免受损伤，黄芩苷能够有效阻断这一过程，从而抑制全腹脏下垂的发生。这一发现为理解细胞死亡机制中的mtDNA功能提供了重要的实验依据。

图6 黄芩苷阻断泛凋亡诱导过程中Z-DNA形成（图源[1]）

进一步研究了黄芩苷在抑制泛凋亡过程中的具体机制，特别是针对Z-DNA的形成及其与ZBP1的相互作用。具体实验思路如下：

1. Z-DNA的形成与mtDNA的关联：

研究表明，mtDNA在基因组不稳定时可能转化为Z-DNA。为了探讨泛凋亡或Ox-mtDNA的释放是否促使Z-DNA的形成，使用了抗Z-DNA/Z-RNA的抗体Z22进行免疫荧光检测。

2. 共定位实验：

免疫荧光显微镜观察显示，泛凋亡诱导时，ASC斑点与线粒体标记（Tom20）和Z22荧光点共定位，表明Z-DNA可能由mtDNA形成，并参与PANoptosome的组装（如图5a和图S9所示）。

3. 确认Z-DNA的性质：

为了验证Z22标记的是Z-DNA而非Z-RNA，进行了DNase I和RNase A的预处理实验。结果表明，仅DNase I预处理能消除Z22的荧光斑点，确认了Z-DNA的形成（如图5b所示）。

4. 抑制剂的作用：

结合使用CsA和VBIT-4，研究发现这一组合显著抑制泛凋亡时Z-DNA的形成及其与ASC的共定位（如图6a所示）。此外，mito-TEMPO也能有效抑制Z-DNA的形成，这与其对细胞死亡的保护效果一致（如图6b所示）。

5. ZBP1的角色：

研究推测Z-DNA可能通过ZBP1激活泛凋亡信号通路。为验证这一假设，使用siRNA对ZBP1进行敲低。Western blotting表明敲低效率约60%（如图7a,b所示）。PI染色和LDH释放实验表明，敲低ZBP1显著减弱了OXO+TNF-α诱导的细胞死亡（如图7c,d所示）。进一步分析发现，ZBP1敲低的细胞泛凋亡信号显著减弱（如图7e,f所示），使用的另一条针对ZBP1的siRNA也获得了类似结果（如图S10a-f所示）。

结论：综合这些实验结果，Z-DNA的形成被确认是由mtDNA转化的，并且其形成在诱导泛凋亡中起到了重要的触发作用。黄芩苷能够有效阻断Z-DNA的形成，从而抑制ZBP1的激活及PANoptosome的组装，进一步减轻细胞死亡。这一研究不仅阐明了黄芩苷的作用机制，也为理解mtDNA及其衍生物在细胞死亡中的角色提供了新的视角。

图7 ZBP1下调可减弱OXO+TNF-α-诱导的泛凋亡（图源[1]）

这部分实验的结果揭示了黄芩苷在HLH（脏器系统激活综合征）小鼠模型中的抗炎作用和对泛凋亡的抑制。具体实验思路如下：

1. HLH小鼠模型的建立：

 使用poly(I:C)和LPS诱导的HLH小鼠模型被建立。该模型与泛凋亡密切相关，能够模拟全身炎症反应。

2. 组织损伤与炎症评估：

组织化学分析显示，HLH小鼠的肺和肝脏表现出明显的损伤，包括肺泡塌陷、血管充血以及免疫细胞浸润（如图8a、8b所示）。

通过生化分析（检测ALT和AST水平）证实了肝损伤的存在。所有这些损伤的参数在口服黄芩苷后得到显著减轻（如图8c、8d所示）。

3. 细胞因子测定：

在poly(I:C)/LPS处理的小鼠中，血清中的TNF-α和IFN-γ水平显著上升，而黄芩苷处理则显著降低了这些细胞因子的水平（如图8e、8f所示）。黄芩苷单独处理并未显著影响这些组织或细胞因子的分泌。

4. 泛凋亡标志检测：

Western blot分析显示，poly(I:C)/LPS诱导的HLH小鼠中，肺和肝组织中的泛凋亡相关标志（如CASP1，GSDMD-NT，cleaved CASP3，GSDME-NT和p-MLKL）显著增加（如图8g、8h、8i、8j所示）。黄芩苷的给药显著降低了这些标志物的表达，表明黄芩苷可以抑制泛凋亡信号。

5. 巨噬细胞的分析：

研究发现，Kupffer细胞在HLH小鼠肝脏中的泛凋亡信号被激活，表现在ASC speck、裂解的CASP3和p-MLKL的聚集体形成。黄芩苷处理后，这些信号明显减少（图9a、9b所示）。这表明黄芩苷能有效抑制Kupffer细胞中的泛凋亡。

结论：本研究证实了黄芩苷作为抗炎剂的有效性，能够通过抑制线粒体Z-DNA的形成以及PANoptosome的组装，减轻HLH小鼠模型中的炎症反应和多器官损伤。特别是，黄芩苷通过抑制肝脏和肺部的泛凋亡信号，显著改善了小鼠的病理状态。这些结果表明黄芩苷可能作为泛凋亡的潜在抑制剂，在泛凋亡相关疾病的治疗中具有重要的应用前景。

图8 黄芩苷减轻HLH小鼠模型的炎症反应和器官损伤（图源[1]）

综上所述，黄芩苷能够抑制mtROS的生成以及Ox-mtDNA和Z-DNA的形成，减少细胞的泛凋亡。可能的机制包括抗氧化作用、对mPTP及VDAC渠道的抑制等。这些机制阻止mtDNA的氧化及其转化为Z-DNA。

在HLH小鼠模型中，黄芩苷显著缓解了脏器损伤和全身炎症，同时抑制了肝脏和肺部的泛凋亡信号。免疫荧光显微镜的结果表明，Kupffer细胞中的泛凋亡标志激活得到了显著抑制，验证了黄芩苷的作用。

这项研究揭示了一种新的机制，即黄芩苷通过阻断线粒体Z-DNA的形成和PANoptosome的组装，以剂量依赖的方式抑制巨噬细胞中的泛凋亡细胞死亡。结果支持黄芩苷作为泛凋亡抑制剂在治疗炎症相关疾病中的潜力。

未来研究应该进一步探讨黄芩苷的具体作用机制，特别是其对mPTP和VDAC通道的影响。更详细地研究ZBP1在泛凋亡中的具体功能及其调节机制，并探讨其他细胞类型（如血管内皮细胞和肝细胞）在泛凋亡中的作用。