探讨细胞应激后，CASP2在泛素化稳态中的作用，特别是其在超载泛素化调节中的角色。实验思路解析：

1. 细胞组分分离：使用HeLa细胞，分离出三种细胞组分：可溶性I（Soluble I）、可溶性II（Soluble II）和颗粒部分（Pellet），以检测不同应激条件下的泛素化水平。

2. 应激处理：细胞接受热休克（HS）或硼替佐米（BTZ）处理，观察这两种处理对可溶性II和颗粒部分中泛素化水平的影响。

3. 液相色谱串联质谱分析：对HS或BTZ处理后的颗粒部分进行LC-MS/MS分析，筛选出204个常见的候选蛋白，进一步分析其在应激条件下的富集情况。

4. 蛋白质富集分析：重点关注与蛋白质质量控制（PQC）相关蛋白，如DAXX、TRIM11、SQSTM1和UBXN1，这些蛋白在颗粒部分中特异性富集，提示它们在应激下发挥功能。

5. CASP2角色验证：观察CASP2在应激处理后的积累情况，发现其在可溶性II和颗粒部分中增加，表明其可能参与调节泛素化。

6. CASP2敲除实验：构建CASP2敲除（CASP2-KO）HEK293T细胞系，评估CASP2缺失对泛素化的影响，发现缺失CASP2后，细胞在恢复阶段的多聚泛素化缀合物积累。

7. 泛素化动态监测：通过观察Ubc9ts的泛素化变化，发现CASP2缺失降低了其周转率，且在恢复过程中，CASP2-KO细胞中仍有未去除的泛素阳性斑点。

 结论：CASP2在细胞应激后被招募到不溶性部分，并在调节超载泛素化中发挥重要作用。CASP2的缺失导致应激诱导的泛素化缀合物积累，影响细胞的蛋白质稳态。

图1 ：CASP2 维持应激后泛素稳态

探究缺陷对细胞应激反应的影响，采用基于串联泛素结合实体（TUBE）的泛素组学分析，以检测在热休克（HS）后CASP2缺失（CASP2-KO）细胞中积累的泛素化蛋白。研究思路解析：

1. 细胞分级：首先对热休克处理后的细胞进行分级，丢弃可溶性I级分，保留剩余的级分进行后续分析。将这些级分与固定的TUBE珠孵育，以捕获泛素化的蛋白质。

2. 数据分析：通过定量质谱（MS）分析TUBE捕获的蛋白质，比较恢复组与HS组中捕获蛋白质的强度。计算恢复组与HS组中蛋白质的比率，发现CASP2-KO细胞中超过80%的蛋白质表现出更高的泛素化水平，表明这些蛋白质在缺乏CASP2的情况下过度泛素化。

3. 筛选与富集分析：筛选出116种不同的蛋白质进行进一步的富集分析，其中11种蛋白质与肌wei缩侧索硬化症（ALS）高度相关，包括TDP-43和TBK1。研究表明，TDP-43和TBK1的过度泛素化和磷酸化是ALS的病理特征。

4. 功能验证：通过拉下实验（pull-down assay）确认CASP2-KO细胞中TDP-43的泛素化水平显著高于对照细胞，并且其周转率较低。观察到在热休克或BTZ处理的细胞中，CASP2与磷酸化的TDP-43共定位，且CASP2-KO细胞在热休克后积累了更多的pTDP-43。

5. 细胞生存分析：CASP2-KO细胞的集落形成效率降低，对BTZ处理更敏感，细胞死亡率升高，进一步证明CASP2缺失导致细胞内异常的蛋白质稳态和病理性蛋白聚集。

结论：CASP2在维持细胞应激后的蛋白质稳态中发挥关键作用，其缺失会导致有毒蛋白质的聚集，这与神经退行性疾病的病理变化密切相关。

图 2：CASP2 缺陷不利于蛋白质组应激后细胞稳态

对缺陷小鼠的运动缺陷进行了深入分析，思路解析如下：

1. 运动功能评估：研究发现，10-14月龄的CASP2敲除小鼠表现出明显的后肢抓握障碍，运动功能受损。这些小鼠在转棒测试和握力测定中显示出运动能力下降，步态分析显示步幅缩短和运动速度降低。

2. 神经肌肉连接分析：通过肌电图测量，发现CASP2缺失小鼠的肌源性运动诱发电位较低，且静息肌电图记录显示腓肠肌存在自发性颤动。这表明上运动神经元和下运动神经元之间的连接存在缺陷。此外，CASP2缺失小鼠的神经肌肉接头（NMJ）数量增加，而脊髓中胆碱乙酰转移酶阳性神经元的数量减少，进一步证实神经肌肉去神经支配的现象。

3. 病理蛋白聚集分析：还观察到，CASP2缺失小鼠的初级运动皮层和脊髓中，Lys48-Ub阳性斑点的数量和大小均显著增加，这些斑点与累积的pTDP-43共定位。这表明TDP-43的泛素化和病理性聚集与CASP2缺失小鼠的运动缺陷相关。

4. 建立TDP-43模型：为进一步验证CASP2在TDP-43相关疾病进展中的作用，对新生小鼠进行AAV-TDP-43注射。结果显示，CASP2缺失小鼠的初级运动皮层中GFP-TDP-43的强度高于对照组，且在不溶性颗粒中积累的GFP-TDP-43更多。这表明CASP2缺失加速了TDP-43病理表型的发展。

5. 对运动行为的影响：运动行为实验表明，注射AAV-TDP-43的CASP2缺失小鼠表现出更严重的运动损伤，静息肌电图记录显示运动单位高频自发放电显著增加。这些结果进一步支持了CASP2在维持蛋白质稳态和神经肌肉连接中的重要作用。

结论：CASP2缺失小鼠的运动缺陷与病理性蛋白质聚集、神经肌肉去神经支配及TDP-43的异常表达密切相关，提示CASP2在神经退行性疾病中的潜在作用。

图 3：CASP2 缺陷小鼠表现出运动缺陷

探讨了caspase-2（CASP2）在细胞应激条件下的作用，特别是它如何参与形成一种新的富含泛素修饰蛋白的生物分子凝聚物，即泛素应激小体（Ubstressome）。这种凝聚物在细胞应激反应中发挥重要作用，该凝聚物通过液-液相分离形成，通常在细胞核周围存在，主要成分包括过载泛素修饰的底物、蛋白酶体和CASP2。研究思路解析：

 实验方法：

（1）免疫共沉淀：通过免疫共沉淀技术，研究人员确认了CASP2与泛素化蛋白的相互作用。

（2）荧光实验：使用稳定表达的单体GFP标记的CASP2，观察其在HEK293T细胞中的动态分布。研究发现，CASP2在应激处理后逐渐浓缩并形成可见的泪点，这表明其参与了凝聚物的形成。观察到CASP2与Ubc9ts的共积累，进一步支持了其在液-液相分离中的作用。

 主要结果：

（1）凝聚物的形成：CASP2与多聚泛素链形成液体状的凝聚物，且这些凝聚物在光漂白后能够恢复，显示出液体特性。

（2）大复合物的鉴定：通过尺寸过滤色谱，发现CASP2参与了一个分子量接近2000 kDa的大复合物，且该复合物中富含与应激相关的泛素化底物。

（3）相分离特性：使用PhaSePred预测相互作用子的相分离特性，发现可溶性II级分中的潜在相互作用子更可能发生相分离。

结论：CASP2在细胞应激反应中通过形成泛素应激小体参与蛋白质质量控制。这一发现为理解细胞如何应对应激提供了新的视角，强调了CASP2在泛素化调节中的重要性。未来进一步研究CASP2与其他蛋白质的相互作用及其在细胞应激反应中的具体机制，将有助于揭示其在细胞生物学中的更广泛功能。

图 4：CASP2 整合到泛素阳性缩合物中

CASP2调控过载泛素的机制进行了深入探索，发现CASP2通过其UIML区域与超载的泛素链结合。研究思路解析：

 1. CASP2的结构与功能：

（1）CARD域的重要性：CASP2包含一个保守的半胱天冬酶激活和招募结构域（CARD），该域对于形成细胞内的模块结构至关重要。

（2）UIML域的发现：研究者发现CARD域中的一个保守序列（Phe102-Thr109，FCEALRET）与经典的泛素结合域（UIM）相似，能够在体外与泛素形成凝聚体。

 2. 突变体分析：通过构建UIML残基突变体（如CARD-3A和CARD-3E），研究者发现这些突变体无法结合泛素链，表明UIML域在结合泛素链中起关键作用。CASP2的CARD结构域被证明能够在体外与多聚泛素链结合，而缺失CARD域的突变体则失去这种能力。

 3. 热休克的促进作用：热休克条件下，CASP2的CARD域与细胞裂解物中的泛素链结合显著增强，而UIML突变体则未能表现出这种结合能力。

 4. 细胞内行为的观察：

（1）凝聚物的形成：在细胞中，野生型CARD结构域（CARD-WT）能够形成凝聚物，而UIML突变体则保持弥散分布，表明UIML域对CASP2的聚集至关重要。

（2）超载泛素化的影响：使用泛素激活酶（E1）抑制剂的处理，阻断超载的泛素化，导致CASP2无法形成可检测的斑点，进一步证明了CASP2的招募依赖于超载泛素链的形成。

结论：CASP2通过其CARD结构域中的UIML域结合超载的泛素链，这一结合对于CASP2的招募到副应激体中是bi不可少的。这一发现为理解CASP2在细胞应激反应中的作用提供了新视角。

图 5：CASP2缀合物与超载泛素化高度相关

CASP2（半胱天冬酶-2）具有针对超载泛素化的去泛素化酶（DUB）活性，这为理解其在细胞应激反应中的作用提供了新视角。

作者推测CASP2可能具有DUB活性，因为其对泛素的作用与许多已知的DUB相似。USP21的过表达会减少细胞中的整体泛素链库，而CASP2则仅减少过量的泛素链，这表明CASP2的DUB活性特异性针对超载的泛素化。验证思路解析：

1. CASP2的活性检测：通过观察CASP2在细胞中的表达和活性形式（全长CASP2和缺失CARD的CASP2）对异位表达的泛素链的影响，确认其去泛素化能力。研究发现，CASP2能够显著降低细胞中外源性泛素链的水平。

2. 突变研究：通过突变分析，确定了CASP2催化口袋中的关键氨基酸残基，这些残基可能参与泛素的识别和切割。特别是，Arg 219、Gln 318和Ala 376的突变会阻止CASP2对泛素链的裂解，表明这些位点在CASP2的DUB活性中起关键作用。

3. 细胞凋亡的关联：研究还发现，CASP2的DUB活性与细胞凋亡之间存在联系。某些突变体（如L439A）在保持去泛素化活性的同时，显著减少了细胞凋亡，表明CASP2的DUB活性可能在应对蛋白质组应激时保护细胞。

4. 酵母模型的验证：研究还扩展到酵母模型，发现酵母中的半胱天冬酶同源物MCA1在应激条件下也能切割泛素链，支持CASP2在维持泛素稳态中的进化保守功能。

结论：CASP2被确认具有针对超载泛素链的去泛素化活性，这一发现不仅揭示了其在细胞应激反应中的新角色，也为理解细胞如何处理蛋白质聚集提供了重要线索。

图 6：CASP2 通过 UIML 结合超载泛素链

图 7：CASP2 是针对超载泛素链的 DUB

CASP2在维持细胞内泛素化稳态方面扮演着关键角色。本研究主要发现：

1.CASP2的功能：

（1）去泛素化活性：CASP2是重要的蛋白酶，能够恢复因应激而超载的泛素化缀合物的稳态。它通过其泛素结合的UIML区域被招募到这些缀合物中，并作为去泛素化酶（DUB）促进底物的降解，从而减轻蛋白质的毒性状态。

（2）du特的切割模式：CASP2的切割偏好与传统的半胱天冬酶不同，它能够靶向多聚泛素链，这一发现加深了对半胱天冬酶切割特异性的理解。

（3）细胞保护作用：CASP2在细胞健康中发挥保护作用，尤其是通过减少病理蛋白TDP-43的积累，表明它在应对细胞应激和维持细胞稳态方面的重要性。

2.生物分子凝聚物：

在应激条件下，超载泛素化缀合物与蛋白酶体形成生物分子凝聚物（副应激体）。与副应激体形成有关的因素包括过度合成泛素并形成多泛素链，蛋白质降解受损，以及错误折叠蛋白质的积累。副应激体可能与多种伴侣蛋白和蛋白酶体相关，这些蛋白在应激下帮助隔离超载的泛素化蛋白质。

3.对神经退行性疾病的影响：

CASP2在神经肌肉去神经支配中发挥作用，缺乏CASP2的小鼠表现出运动神经元疾病的常见表型。这表明促进CASP2的激活可能是恢复蛋白酶体功能的一种新方法，并可能为治疗ALS提供潜在的策略。

总结：CASP2作为一种应激半胱天冬酶，不仅在细胞凋亡和存活中具有双重作用，还在维持泛素稳态和应对细胞应激中发挥重要作用。其du特的切割模式和在副应激体形成中的角色为理解细胞应激反应提供了新的视角。

参考文献：

[1] Ge, Y., Zhou, L., Fu, Y. et al. Caspase-2 is a condensate-mediated deubiquitinase in protein quality control. Nat Cell Biol (2024). doi:10.1038/s41556-024-01522-8