“线粒体功能障碍+乳酸化+细胞衰老”轻松拿下Eur Heart J
时间：2024-11-19 阅读：88
动脉粥样硬化与衰老密切相关，是全球主要的死亡原因之一。越来越多的证据表明，血管平滑肌细胞（VSMC）的衰老在动脉粥样硬化的形成中发挥重要作用。
VSMC的衰老不仅导致其数量减少，还影响了斑块破裂后的修复能力，进而增加斑块的脆弱性。因此，深入探讨VSMC衰老的新机制并寻找新的治疗靶点是推动动脉粥样硬化治疗的重要方向。
细胞衰老通常是由多种因素引发的应激反应，导致细胞不可逆地停止生长。衰老细胞会释放出多种生物活性物质，称为衰老相关分泌表型（SASP），这些物质破坏了组织微环境，并引发衰老相关的炎症反应。关于SASP在VSMC衰老及动脉粥样硬化中的表观遗传调控仍存在明显的研究空白。
衰老的VSMC经历了从线粒体氧化磷酸化到有氧糖酵解的代谢转变，这种转变导致乳酸的积累。乳酸不仅是能量代谢的重要调节剂，其过高的水平还被认为与多种疾病的发展相关。因此，揭示乳酸及其代谢产物对衰老和动脉粥样硬化的影响，将为理解这一疾病提供新视角。
肿瘤坏死因子受体相关蛋白1（TRAP1）是热休克蛋白家族的重要成员，参与细胞的代谢和稳态调节。已有研究表明，线粒体基因TRAP1在调控乳酸积累方面发挥着作用，并与衰老相关疾病密切相关，但其在动脉粥样硬化中的具体功能尚未被充分探索。
本研究全面探讨TRAP1在VSMC衰老和动脉粥样硬化中的作用。研究证明HDAC3是调节血管平滑肌细胞（VSMC）衰老中H4K12la的重要因子，促进SASP表达并加速细胞衰老，同时阐明了能量代谢与表观遗传功能的联系，为衰老相关疾病（如动脉粥样硬化）的治疗提供了新见解与策略。
相关研究由南京医科大学药学院团队于2024年8月1日发表在心血管顶级期刊European Heart Journal (欧洲心脏病学杂志，IF=37.6) 。具体研究思路解析如下：
研究目标：旨在探讨线粒体基因TRAP1在血管平滑肌细胞（VSMC）衰老中的作用，特别是在动脉粥样硬化和高脂饮食条件下TRAP1的表达如何影响细胞衰老过程。
方法步骤：
（1）数据库整合与基因筛选：研究者整合了衰老相关数据库和MitoMiner数据库，发现在Ras诱导的人VSMC中TRAP1显著上调，提示其可能与衰老相关。
（2）样本分析：对动脉粥样硬化患者和高脂饮食喂养的ApoeKO小鼠的主动脉组织进行分析，结果显示TRAP1及衰老标志物（如P53、P21、P16）的表达水平升高，表明TRAP1与VSMC衰老相关。
（3）免疫荧光染色：通过免疫荧光染色观察TRAP1与血管平滑肌细胞标记物α-SMA的共定位，进一步确认TRAP1在动脉粥样硬化斑块中的表达。
（4）TRAP1敲低：进行TRAP1敲低实验，发现TRAP1的缺失可以显著降低Ras诱导的衰老标志物，并改善线粒体功能和能量代谢。
（5）TRAP1过表达：过表达TRAP1的细胞实验显示，TRAP1过表达会显著促进VSMC的衰老，提示TRAP1在细胞衰老中的促效应。
（6）衰老特征评估：评估VSMC衰老的特征，包括表型转变（收缩表型相关基因表达下降，合成表型相关基因表达上升）、SA-β-Gal阳性细胞的数量以及细胞增殖能力的变化。
（7）SASP分析：研究TRAP1对衰老相关分泌表型（SASP）的影响，发现TRAP1沉默显著降低了SASP的上调。
结果总结：证实TRAP1作为一种与衰老相关的线粒体基因，对VSMC的衰老具有积极促进作用。TRAP1的表达水平与动脉粥样硬化和细胞衰老密切相关，其缺失可改善线粒体功能并延缓衰老过程，而过表达则加速衰老。这些发现为理解细胞衰老机制提供了新的视角，并可能为相关疾病的治疗提供潜在的靶点。
图1 TRAP1调节VSMC衰老
研究目标：探索TRAP1在Ras诱导的人血管平滑肌细胞（VSMC）中的作用，特别是其如何影响线粒体功能和能量代谢。
实验设计：
（1）缺失TRAP1的影响：比较TRAP1缺失与正常情况对于线粒体损伤及代谢变化的影响，采用线粒体染色与Seahorse实验测定线粒体功能和糖酵解活性。
（2）代谢产物的检测：评估缺失TRAP1后，乙酰辅酶A和柠檬酸的水平，分析能量代谢的转变趋势。
（3）关键酶的表达检测：
通过Western blot和qPCR检测糖酵解限速酶（如PFK1、HK2、PKM2）以及参与三羧酸循环（TCA）和电子传递链的酶的表达与活性。观察TRAP1缺失是否上调PFK1的表达，并分析这种变化对其他代谢途径的影响。
（4）相互作用分析：
使用共免疫沉淀（CoIP）等技术验证TRAP1与PFK1之间的相互作用。检测TRAP1对PFK1泛素化水平的影响，分析其如何通过降低泛素化促进PFK1表达。
（5）干预实验：
通过使用TRAP1抑制剂G-TPP和小干扰RNA（siRNA）靶向TRAP1，观察对VSMC代谢的影响。检测PFK1抑制剂对TRAP1过表达VSMC中线粒体功能的改善作用。
结果分析：TRAP1缺失能改善Ras诱导的VSMC线粒体损伤，减少能量代谢对糖酵解的倾斜，同时提高氧化磷酸化水平。PFK1的过表达对电子传递链的活性产生抑制作用，TRAP1通过与PFK1相互作用，在调节糖酵解途径上发挥关键作用。
结论：TRAP1通过上调PFK1的表达，抑制TCA循环和电子传递链活性，从而影响VSMC的能量代谢。这一发现强调了TRAP1在衰老和动脉粥样硬化中的重要角色，为未来治疗策略的开发提供了新的视角。
图2 TRAP1是衰老VSMC中能量重编程的关键调节因子
研究背景：研究关注TRAP1在衰老人血管平滑肌细胞（VSMC）中对乳酸生产的影响，以及乳酸在细胞衰老中的作用。
实验目标：
（1）确定TRAP1敲低对VSMC中乳酸水平的影响。
（2）测试外源性补充乳酸是否能够逆转TRAP1敲低所引起的细胞衰老。
实验设计：
（1）TRAP1敲低：通过小干扰RNA（siRNA）靶向TRAP1，观察衰老VSMC中的乳酸产量变化，使用Seahorse实验测定细胞的代谢功能，并通过Western blot（WB）和SA-β-Gal染色来评估细胞衰老和相关标志物的表达。
（2）外源性乳酸补充：在TRAP1敲低后补充外源性乳酸，检测其对细胞衰老指标的影响。
（3）乳酸抑制实验：使用糖酵解抑制剂2-DG、乳酸脱氢酶抑制剂和针对乳酸脱氢酶的siRNA来降低乳酸产生，观察这些处理对VSMC衰老的影响。
结果分析：
（1）发现TRAP1敲低确实降低了衰老VSMC中的乳酸产量，同时补充乳酸可以逆转TRAP1敲低引起的衰老现象，包括衰老标志物的减少和细胞增殖能力的提升。
（2）糖酵解抑制剂和乳酸脱氢酶的抑制也显著降低了乳酸水平，并减轻了VSMC的衰老表现，进一步支持乳酸积累与TRAP1诱导衰老之间的关系。
结论：研究结果支持TRAP1通过增加乳酸积累来促进VSMC衰老的假设，说明乳酸作为关键代谢物在细胞衰老中的重要性。
图3 TRAP1介导的乳酸积累促进VSMC衰老
研究背景：本研究探讨TRAP1介导的乳酸积累如何通过组蛋白H4K12乳酸化（H4K12la）促进衰老的血管平滑肌细胞（VSMC）中衰老相关分泌表型（SASP）的激活。
实验设计：
（1）TRAP1敲低：通过敲低TRAP1，观察Ras诱导的人VSMCs中整体蛋白乳酸化（特别是H4K12la）水平的变化，主要借助Western blot分析。
（2）H4K12la定位：使用超分辨率荧光成像观察H4K12la在衰老VSMCs中的定位，尤其是在核膜的富集情况。
（3）外源乳酸补充：补充乳酸以检测其是否能恢复TRAP1敲低后H4K12la水平的变化。
（4）验证H4K12la与SASP的关系：
通过ChIP-qPCR和核跑胶实验确认H4K12la在SASP启动子区域的富集，进而分析H4K12la对SASP转录的影响。
（5）HDAC3的作用：
研究HDAC3在调节H4K12la和SASP中的作用，评估p300和HDAC1-3的催化功能，特别观察HDAC3在Ras诱导的hVSMC中的表达变化。验证乳酸如何影响HDAC3的表达，并通过Western blot和免疫荧光染色确认其对H4K12la水平的影响。
（6）干预实验：
过表达HDAC3以评估其对H4K12la、衰老标志物和SASP表达的影响，使用转录技术检测新生SASP转录物的变化。
（7）HDAC激动剂的实验：
使用HDAC激动剂ITSA-1进一步验证HDAC3在H4K12la介导的衰老中的作用，观察其对H4K12la和SASP转录的影响。
研究结论：乳酸通过下调HDAC3表达，增加H4K12la水平，进而促进VSMC的衰老和SASP的激活。这一机制提供了TRAP1在细胞衰老中的新见解，强调了乳酸和表观遗传修饰在衰老过程中的重要性。
图4 TRAP1介导H4K12la促进衰老VSMC中SASP激活
本研究旨在探讨HDAC3在Ras诱导的衰老VSMCs中的作用，以及乳酸如何通过调节HDAC3表达来影响VSMC衰老和SASP（衰老相关分泌表型）的表达。
实验目标：
确定Ras诱导的VSMCs中HDAC3的表达变化。
探究TRAP1敲低或乳酸如何影响HDAC3的表达。
评估HDAC3过表达对VSMC衰老及SASP表达的影响。
验证HDAC3激动剂ITSA-1在抑制H4K12乳酸化和衰老方面的作用。
实验设计：
Western blot分析：检测Ras诱导的VSMCs中HDAC3的表达变化。过表达实验：通过过表达HDAC3来观察其对VSMC衰老及SASP表达的影响。
抑制剂实验：使用HDAC3激动剂ITSA-1来验证其对H4K12乳酸化和衰老的影响。
染色质免疫沉淀（ChIP）实验：检测H4K12乳酸化在SASP启动子处的富集情况。
关键步骤：
HDAC3表达检测：通过Western blot分析发现Ras诱导的VSMCs中HDAC3蛋白表达显著下调。
TRAP1和乳酸的影响：TRAP1敲低或添加乳酸可以进一步下HDAC3的表达
HDAC3过表达实验：通过过表达HDAC3，发现其可以显著减H4K12乳酸化，降低衰老标志物和SASP的表达，恢复细胞增殖能力。
HDAC3激动剂实验：使用HDAC3激动剂ITSA-1可以有效防止H4K12乳酸化和衰老的增加。
ChIP实验：验证HDAC3过表达对SASP启动子处H4K12乳酸化和相关组蛋白修饰的影响。
结果分析：
Ras诱导的VSMCs中HDAC3表达显著下降。
TRAP1敲低或添加乳酸可以进一步下调HDAC3的表达。
HDAC3过表达可以显著减少H4K12乳酸化，降低衰老标志物和SASP的表达，恢复细胞增殖能力。
HDAC3激动剂ITSA-1可以有效防止H4K12乳酸化和衰老的增加。
ChIP实验显示，HDAC3过表达显著降低SASP启动子处H4K12乳酸化和相关组蛋白修饰的水平。
结论：
（1）乳酸通过抑制HDAC3的表达来增加H4K12乳酸化，从而促进VSMC衰老。
（2）HDAC3的过表达可以减少H4K12乳酸化，降低衰老标志物和SASP的表达，恢复细胞增殖能力。
（3） HDAC3激动剂ITSA-1可以有效防止H4K12乳酸化和衰老的增加，支持HDAC3在VSMC衰老中的关键作用。
通过这些实验，揭示了HDAC3在VSMC衰老和SASP表达中的重要作用，为治疗衰老相关疾病提供了新的靶点和策略。
图5通过阻断 HDAC3 上调 H4K12la 可促进 VSMC 衰老
研究目标：探索SMC特异性TRAP1敲除在高脂饮食（HFD）喂养的Apoe KO小鼠中对主动脉动脉粥样硬化（AS）的影响，包括斑块面积、稳定性、衰老VSMC数量、H4K12乳酸化、能量代谢和SASP表达等。
实验设计：
小鼠模型：使用Apoe KO小鼠建立SMC特异性Trap1敲除小鼠（Apoe KO Trap1 SMCKO），并喂养它们正常饲料（NC）或高脂饮食（HFD），持续16周。
斑块分析：采用Oil Red O染色观察主动脉中的脂质斑块面积和稳定性，通过免疫组织化学染色进一步评估斑块的稳定性。
衰老和能量代谢检查：通过免疫荧光染色和Western blot分析衰老标志物（如P21）和H4K12乳酸化的表达，同时评估SASP因子和细胞能量代谢的变化。
关键步骤：
斑块面积测定：比较HFD喂养的Apoe KO Trap1 WT与Trap1 SMCKO小鼠，观察主动脉斑块面积的变化。
衰老及乳酸化水平评估：使用P21和α-SMA的免疫荧光染色确认VSMC衰老，同时检测H4K12乳酸化水平。
分化状态及表型分析：评估在HFD喂养下VSMC的收缩表型与合成表型基因的表达变化。
结果分析：
斑块面积和稳定性：发现Trap1敲除小鼠中的斑块面积显著减少，且斑块更稳定。
衰老VSMC的减少：Trap1 SMCKO小鼠中衰老VSMC数量减少，H4K12乳酸化水平显著降低，表明TRAP1在VSMC衰老中扮演重要角色。
能量代谢与SASP的改善：Trap1敲除导致乳酸产生和SASP表达显著下降，说明VSMC的能量代谢得到改善。
结论：
（1）TRAP1通过增加H4K12乳酸化来促使VSMC衰老，从而推动动脉粥样硬化的发展。
（2）SMC特异性Trap1敲除能够显著降低斑块面积、增强斑块稳定性，并改善VSMC的代谢状态及衰老特征，提示TRAP1可能是动脉粥样硬化治疗的新靶点。
图6 SMC 特异性Trap1敲除可改善动脉粥样硬化
研究目标：探讨TRAP1抑制剂G-TPP在高脂饮食（HFD）喂养的Apoe KO小鼠中对主动脉动脉粥样硬化（AS）发展的影响，包括斑块面积、坏死核心大小和胶原含量的变化。
实验设计：
小鼠模型：将HFD喂养的Apoe KO小鼠分为G-TPP处理组与对照组。毒性和代谢参数监测：在给予G-TPP后，监测小鼠的代谢参数确保不会对其代谢造成负面影响。
斑块分析：通过油红O染色、Masson染色、Sirius Red染色和H&E染色来评估主动脉斑块面积、坏死核心大小及胶原含量。
衰老标志物检测：使用免疫荧光染色和Western blot分析P21、H4K12乳酸化（H4K12la）信号和SASP因子的表达。
关键步骤：
斑块和胶原分析：比较G-TPP处理组与对照组小鼠主动脉的斑块特征，包括面积、坏死核心大小及胶原含量。
衰老与乳酸化水平测定：观察G-TPP处理是否能显著降低VSMC中的P21和H4K12la水平，并评估MOVAS细胞中的衰老标志物和SASP的表达。
结果分析：
斑块改善：G-TPP处理显著降低了HFD喂养的Apoe KO小鼠的主动脉斑块面积和坏死核心大小，同时增加了胶原含量，表明动脉粥样硬化得到了改善。
衰老标志物的变化：在G-TPP治疗后，免疫荧光和Western blot分析显示小鼠主动脉中的P21和H4K12la信号显著降低，表明VSMC的衰老程度减轻。
SASP的降低：G-TPP处理降低了MOVAS细胞中的SASP因子的表达，进一步支持了TRAP1抑制对衰老和炎症反应的影响。
结论：
使用TRAP1抑制剂G-TPP可以有效减缓HFD诱导的动脉粥样硬化发展，通过降低斑块尺寸、增加胶原含量及减少VSMC的衰老标志物，建立了TRAP1作为动脉粥样硬化治疗的新靶点。这些结果表明，抑制TRAP1可能是一种有前景的动脉粥样硬化治疗策略，值得在未来进行更深入的研究和临床应用探索。
图7 TRAP1 的药理学抑制可抑制体内动脉粥样硬化发展
研究目标：探讨通过PROTAC技术降解TRAP1作为治疗动脉粥样硬化的新策略，相较于传统抑制剂，靶向蛋白降解具有更高的疗效和特异性。
实验设计：
（1）候选化合物：识别小分子化合物16b（BP3），该化合物能够促使TRAP1通过泛素化机制降解，依赖于cereblon（CRBN）。
（2）TRAP1降解实验：通过Western blot分析评估BP3对TRAP1蛋白的降解效果，观察在不同浓度下TRAP1的变化。
（3）评估细胞毒性：实施初步毒性评估，确认BP3在高浓度下对细胞的毒性有限，确保其应用安全。
（4）体内实验：
小鼠模型：在高脂饮食（HFD）条件下对ApoeKO小鼠进行BP3治疗，分析其对斑块面积、坏死核心和胶原蛋白含量的影响。
生理参数监测：监测小鼠在治疗前后的体重、血压和血脂，确保BP3对这些生理参数没有显著影响。
实验结果：BP3能够有效诱导TRAP1的降解，显著减少VSMC的衰老和动脉粥样硬化的相关病变；BP3治疗后，小鼠主动脉中的斑块面积和坏死核心显著减少，并且胶原含量增加，显示出动脉粥样硬化的改善；还发现BP3处理降低了相关衰老标志物、H4K12la和SASP的表达，体现出TRAP1的降解效果。
结论：通过BP3降解TRAP1，显示出其作为动脉粥样硬化治疗的新方式的潜力。这一研究结果为未来的临床应用提供了实验基础。
图8 通过 PROTAC 降解 TRAP1 治疗动脉粥样硬化
本研究发现线粒体蛋白TRAP1在血管平滑肌细胞（VSMC）衰老及动脉粥样硬化中起重要作用，诱导组蛋白微环境变化并促进衰老进程。
TRAP1的上调促进糖酵解，导致乳酸积累。积累的乳酸通过抑制组蛋白赖氨酸去乙酰化酶HDAC3，增强H4K12乳酸化（H4K12la），从而促进衰老相关分泌表型（SASP）转录，加剧动脉粥样硬化。这一机制揭示了细胞代谢与表观遗传调控之间的相互作用，为TRAP1作为潜在治疗靶点提供了依据。
TRAP1的作用：TRAP1是线粒体功能的重要调节因子，其基因敲除小鼠在与年龄相关的疾病中表现出的发病率降低。此研究中，TRAP1在衰老VSMC中的过表达导致糖酵解上调，从而影响能量代谢。
组蛋白乳酸化的作用：组蛋白乳酸化在多种生物过程中发挥重要作用，并在与衰老相关的SASP激活中起关键角色。本研究强调H4K12la在衰老特异性染色质微环境的构建中的作用。
HDAC3作为关键因子：HDAC3被确定为调节H4K12la的重要酶，它的抑制导致H4K12la水平升高，SASP增强，进而促进VSMC衰老，为动脉粥样硬化的治疗提供了新的靶点。
代谢与表观遗传学的交互：研究揭示了乳酸代谢与组蛋白修饰之间的新联系，表明代谢信号在衰老和动脉粥样硬化中的重要性，提出代谢-表观遗传串扰的观点，并引出对其他代谢中间体的研究。
细胞衰老对健康的影响：细胞衰老与多种疾病密切相关，包括心血管疾病，线粒体功能损伤和代谢异常在细胞衰老中起核心作用。本研究指出：
（1）衰老的VSMC中糖酵解水平升高，推动进一步探索细胞代谢重编程的机制；
（2）研究还指出肿瘤药物（如他莫昔芬和TRAP1抑制剂G-TPP）在动脉粥样硬化治疗中的潜在应用，强调了重新利用抗肿瘤药物来应对衰老驱动的心血管疾病的可能性；
（3）PROTAC BP3作为新型药物，能够高效诱导TRAP1降解，显示出治疗动脉粥样硬化的潜力，并具备较高的选择性和较低的细胞毒性。
局限性与未来研究方向：尽管乳酸对HDAC3的抑制影响明显，但其具体机制仍需进一步研究，未来在细胞代谢与表观遗传学交互方面的研究仍有广阔空间。
参考文献：
[1] Li X, et al. TRAP1 drives smooth muscle cell senescence and promotes atherosclerosis via HDAC3-primed histone H4 lysine 12 lactylation. Eur Heart J. 2024 Aug.
doi:10.1093/eurheartj/ehae379