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猪肺炎支原体(MP)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒实验说明

l本试剂盒仅供科研使用。

l本试剂盒用于体外定性检测猪血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中猪肺炎支原体(MP)水平。

l有效期：6个月

l保存条件：2-8℃

实验原理：

  本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中猪肺炎支原体(MP)。用纯化的猪肺炎支原体(MP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中猪肺炎支原体(MP) 相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的猪肺炎支原体(MP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中猪肺炎支原体(MP)的存在与否。

猪肺炎支原体(MP)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒组成：

试剂盒组成 48孔配置 96孔配置 保存

说明书 1份 1份 R.T.

封板膜 2片（48） 2片（96） R.T.

密封袋 1个 1个 R.T.

酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存

阴性对照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存

阳性对照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存

酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存

浓缩洗涤液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存

猪肺炎支原体(MP)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒样本处理及要求：

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

猪肺炎支原体(MP)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒操作步骤：

1.编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）

2.加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。   

4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

结果判定：

  试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00; 阴性对照平均值≤0.10

  临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15

  阴性判定：样品OD值< 临界值（CUT OFF）者为猪肺炎支原体(MP) 阴性

  阳性判定：样品OD值≥ 临界值（CUT OFF）者为猪肺炎支原体(MP) 阳性

注意事项

1．操作严格按照猪肺炎支原体(MP)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。

2．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

4．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5．底物请避光保存。

6．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为630nm

7．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M的硫酸，使用时必须注意安全。

保存条件及有效期

1．试剂盒保存：2-8℃。

2．有效期：6个月