质粒提取原理及流程
质粒提取试剂盒简介：
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒提取原理及流程：
较常用的质粒DNA提取方法有3种：碱裂解法、煮沸法和去污剂(如Triton和SDS)裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒(<15kb)。去污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒(>15kb)。碱裂解法是一种应用为广泛的制备质粒DNA的方法，其原理为：染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性时即恢复其天然构象；变性染色体DNA的片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，离心去除沉淀后，就可从上清中回收质粒DNA。目前，市面上质粒提取试剂盒大多数都是采取上述的碱裂解方法，不同之处在于纯化方式。目前比较常用的纯化系统是硅基质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，然后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。
影响质粒提取的因素：
质粒提取的得率和质量与很多因素有关，如宿主菌的种类和培养条件、细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附柱的吸附量等。
宿主菌种类
质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，多数情况下我们是从大肠杆菌中提取质粒。大肠杆菌的菌株不同会影响质粒提取的质量。从宿主菌如DH5α和*0中可以得到高质量的质粒DNA。HBl01和它的衍生菌株，如TG1和JM系列会在裂解时产生大量的糖类，如果没有*去除，将抑制后续实验中的酶活性，影响质粒DNA提取的质量。另外，有些菌株有非常高的内切酶活性，会降低DNA的得率。因此推荐使用DH5α和*0来提取质粒DNA。
培养时间
从固体培养基平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(含有相关抗生素的液体培养基中)，振荡培养12-16小时。不应超过16小时，因为这时细胞开始裂解，使得质粒的得率降低，也会导致质粒丢失或质粒变异。
质粒扩增
氯霉素能抑制宿主细胞蛋白质和DNA的合成，但对松弛型质粒的复制没有影响。因此，在细菌培养液中加入氯霉素可提高松弛型质粒的拷贝数。由于氯霉素抑制了宿主细胞蛋白质和DNA的合成，从而抑制了染色体的复制，但质粒复制所用的酶半衰期较长，故质粒仍可继续复制，这样既可增加质粒产量，又可降低细胞的数量，使细菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于扩增的氯霉素浓度为170ug/ml 。
抗生素
在菌株的各生长阶段都应加入抗生素筛选。现在用的许多质粒都不含有在细胞分裂时确保平均分配的par位点，无质粒的子细胞在无抗生素时复制速度远大于含质粒的细胞。
几种常用抗生素的浓度
质粒拷贝数:
质粒拷贝数常用的定义是指生长在标准的培养基下每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的起始复制机制。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1-2个质粒，如F因子；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒，如ColEl质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型，分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
部分质粒的拷贝数
菌液收集及裂解
细菌收集可以通过离心来进行，不同的质粒拷贝数，菌液量的需求不同，对于低拷贝的质粒，要相应增加菌液的量。菌液是在碱性环境下裂解的，由于不同的宿主菌细胞壁厚薄的差异，细胞的破壁程度不同， 对于细胞壁较厚的宿主菌， 先要进行破壁处理：
革兰氏阴性菌——不用特殊处理，碱裂解时就能有效破壁
革兰氏阳性菌——溶菌酶处理
酵母和丝状真菌——酵母破壁酶或玻璃珠
菌液收集、重悬以及宿主菌细胞破壁后，细胞在含有RNase A的NaOH/SDS(溶液Ⅱ)中裂解。SDS溶解细胞膜的磷脂和蛋白成分，使细胞的内容物如染色体、质粒DNA和蛋白在碱性环境下变性。佳的裂解时间是质粒大量释放而没有释放染色体DNA的时间，尽量缩短质粒暴露在变性环境中。长时间处在碱性环境中会导致质粒发生不可恢复的变性。变性的质粒在琼脂糖胶上跑的较快，而且不能被限制性内切酶消化。裂解产物在溶液Ⅲ中被调整到中性高盐环境，高盐使得变性的蛋白、染色体DNA、细胞碎片和SDS都沉淀下来，而质粒复性留在上清溶液中。溶液要*混匀以确保沉淀*。为了防止染色体DNA污染质粒DNA，要避免剧烈振荡，以防止染色体DNA被打断，造成对质粒DNA的污染。因为染色体DNA的片段和质粒DNA在高盐条件下，都可以与硅胶膜结合，在低盐的条件下，用洗脱液都能从膜上洗脱下来。因此，在裂解过程中要缓慢、轻柔颠倒离心管。
质粒DNA分离和纯化：
纯化要求
质粒DNA中不应存在对后续实验中的酶活性有抑制作用的有机溶剂分子或过高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖、脂类、基因组和RNA的污染。不同的后续实验对于质粒纯度的要求不同，常规的分子生物学实验(如酶切、测序等)普通纯度的质粒即可满足实验，而对于转染实验，要求质粒的纯度较高(如高纯度或无内毒素)。可以选择不同的质粒提取试剂盒以满足不同的实验要求。
纯化方法
用硅基质材料吸附质粒DNA来代替乙醇沉淀的纯化方式，提取的质粒纯度高、操作方便快捷，可选择的试剂盒有两种类型，即普通质粒提取试剂盒和无内毒素质粒提取试剂盒。
质粒DNA的洗脱和收集
参见基因组DNA提取
质粒的保存
溶解在洗脱液TE中的质粒DNA，也可以贮存在TE缓冲液中(用水溶解的质粒只能短期保存，因为实验室用的纯水呈弱酸性，质粒在酸性环境下会发生磷酸解)，4℃短期保存或-20℃和-70℃长期保存，也可在含有质粒的细菌培养物中，加等体积甘油，于-70℃保存 。
质粒鉴定与评价：
琼脂糖电泳检测
碱裂解法提取的质粒经琼脂糖电泳进行鉴定时，理想状况是只出现超螺旋—条带，但在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等原因，使质粒DNA链发生断裂，可能出现两条带或者出现三条带，这三条带电泳迁移率从快到慢，分别是超螺旋、开环和复制中间体(即没有复制*的两个质粒粘连在—起)。如果加溶液Ⅱ后过度振荡，会在远离这三条带的位置出现条带，这条带泳动得较慢，是大肠杆菌基因组DNA的片断。非常偶然的是，有时候提取的质粒会出现4个以上的条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋(超螺旋的圈数不同)所致。但是，只要质粒经单酶切鉴定后，只有单一条带，就证明没有基因组的污染。
酶切检测
质粒提取后，为了进—步鉴定质粒的正确与否，就要进行酶切鉴定，通过与Marker对比，确定质粒的分子量大小。
用紫外线分光光度计检测浓度测定标准为：OD 260 值为1相当于大约50ug/ml双链DNA。OD 260 /OD 280 比值在1.7-1.9之间说明所得DNA纯度较好。OD 260 /OD 280 比值若低于1.7说明可能有蛋白污染。OD 260 /OD 280 比值若高于2.0则说明DNA有可能已降解。如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子浓度会影响光吸收值，但并不表示纯度低。
