上海远慕讲解ELISA实验操作流程

ELISA实验的操作流程，以下就是远慕生物技术老师的详解！

ELISA有白底（上图，不可拆）和黑空板子（可拆，8个一排，12排）。用吸光度（一般是450nm的OD值）来检测，就只能用白底的板子。黑底的板子可以用Lumin读数。
步，拿到板子，还有封盖膜。
第二步：用100ul包被抗体，包被好板子之后，轻弹混匀。将封盖膜的白色撕去，用透明有粘性的膜，贴在板子上，把膜压紧（贴膜是为了防止液体挥发，所以一定要把每孔黏牢）。
室温孵育guoy。

注意事项：
1.如果一次只做一部分孔，贴膜可以剪刀剪开，只用一部分。保证膜可以把加液后的孔盖住就可以。
2.加样时候，一定要保证每孔加样量*一样。避免因为操作原因，每孔液体量有区别。ELISA比较敏感，操作误差会导致zui后读数有不小的差别。
3.加的样，保证样品加在孔底，不要粘在管壁上，减少孔与孔之间的差异。
第二天早上，来洗掉包被液。

注意事项：
1. ELISA用的所有液体系统，记得一定要预先调PH值到7.2-7.4之间，按照说明书都无菌过滤过。1XPBS的PH值在7.68左右，仍然需要加盐酸调酸一点。Trizma base配出来，PH在9.98,必须调PH!否则ELISA中抗原抗体根本不能正常结合。蛋白对于PH值极度敏感。
2. 无菌要求多高，现在不知道。建议无菌配好的液体放在4度冰箱保存。每次用之前，放在室温下至少15分钟。ELISA用的液体，室温的温度，效果比较好。
洗包被液的时候，直接把板子翻过来，弃掉液体。在厚厚的吸水纸上，用力拍打板子，力求把孔中的液体*弃干净。
用WASH BUFFER洗涤三次。因为孔的容量是400UL,但是300UL基本就可以把孔覆盖满。所以，建议洗板子的时候，每孔加350ul左右。

注意事项：
1.每次洗涤的时候，尽量拍干孔中液体。这样洗涤得比较干净。
2. 孔中没有液体时候，动作一定要快！！！ELISA包被后的孔，不能干掉！否则非常影响结果。
3.封闭。
用是1%BSA in 1XPBS. 无菌过滤，4度保存，用之前放在室温复温。
封闭液可以封闭全孔，所以每孔加300UL封闭液，室温1小时。
4. 弃掉封闭液，拍干。
洗涤三遍。步骤如前。
5. 加标准品和样品。
标准品储存浓度很高，而且蛋白很忌反复冻融。建议次使用时，分装。可以48孔一只，-80度冰箱保存，可以有效保存半年。4度保存，有效期是60天，而且浓度会衰减。
取16孔标准品的量。举例，我的标准品储存浓度是270ng/ml, 标准品分7个点，浓度是1000pg/ml，每孔100ul, 2倍递减，所以是1000， 500， 250， 125， 62.5 ， 31.2， 15.6 pg/ml, 7个孔我需要0.2ng标准品。
做ELISA必须有复孔。所以，两排14个孔我需要0.4ng标准品, 1.5ul。

标准品稀释步骤：
取7个EP管，第1管放400ul缓冲液，第2到7管放200ul缓冲液。将1.5ul标准品加入到管中，200ul枪轻轻吹打混匀。从第1管中取200ul加入第2管中，吹打均匀。依次稀释。第7管有400ul液体，zui后只用200ul。
标准品加样步骤：
从第1管中取100ul加到A1孔，再100ul加到A2复孔中。
第2到7孔，参考上述步骤。
第8孔，H1和H2加没有标准品的缓冲液，作为阴性对照。

样本加样：
血清或者细胞上清，解冻之后混匀，建议3000RPM离心10分钟，沉淀液体中的固体杂质。
按照顺序，每孔加100ul样本，记得做复孔。加样体积一定要一样，但是动作要快。样本还是一定要保证加到管底，不要粘附到管壁上。
标准品和样品，每孔100ul，室温孵育2小时。
6. 弃掉液体，拍干。洗涤3遍。
7. 加检测抗体（detection antibody,尾端有生物素biotin），每孔100ul（储存液也是放-80度，用之前解冻后加缓冲液混匀，稀释到工作浓度，缓冲液的PH值都已经调到7.2-7.4之间）。
室温孵育2小时。
备注：以上这些步骤没有要求避光。所以，每次加样之后，只要保证把贴膜都贴牢，防止液体蒸发和孔间干扰即可。
板子可以放在操作台上。
不过因为操作习惯，即使不避光的步骤，也可以把板子放在室温的抽屉里。
8.弃掉检测抗体液，拍干。
洗涤三遍。
9. 加Streptavidin-HRP(亲和素-辣根过氧化物酶)，这个一直4度保存，使用的时候200倍稀释（96孔，9.6ML液体，加48ul的Streptavidin-HRP，9552ul的缓冲液）。
100ul每孔，室温，避光（这步开始要避光），孵育20分钟。
10. 弃掉液体，拍干。洗涤三遍。
11. 加底物液（substrate solution）,A液：B液=1:1，用之前临时混起来。储存的时候A，B两液分别储存在4度冰箱。
每孔100ul（等于每孔A液50ul，B液50ul），室温，避光，20分钟。

说明：
1. 加AB液之后，白色的孔就会显色。淡绿色，颜色深浅跟目标蛋白浓度正相关。
2. 生物素与亲和素结合，可以放大免疫反应的效应，便于显色。
3.ELISA包被的板子采用平底（flat），大概60个96孔板，260美元左右。
白色的板子虽然不能拆卸，但是不用的孔，只要别污染，下次可以用，所以一块板子等同于可以拆开来用。
12. 保留AB液在孔内，直接每孔加50ul的终止液（2N H2SO4）。终止液也是公司买的专门ELISA用的。
加完终止液，轻弹板子，混匀。可以看见淡绿色变为亮黄色。黄色的颜色深浅，与绿色一致，与目标蛋白的浓度成正相关。
加完终止液，立即到机器上读数。选择450nm，测OD值。
说明：不常做ELISA的实验室，请务必在实验之前，确认吸光度检测仪器在正常使用状态。如果仪器状态不好，读数不准，ELISA的结果也不可信。