Waters2695液相色谱仪HPLC操作规程

[目的]
    规范Waters液相色谱系统的使用和维护。

[范围]
    本规程适用于Waters液相色谱系统的使用和维护。
[职责]
    质检室仪器分析员负责Waters液相色谱系统的日常使用和维护。
[系统组成]
    本系统由Waters 600E多溶剂输送系统（有梯度控制器的高压输液泵）、Waters在线脱气机、Rheodyne 7725i手动进样阀、Waters 2487双通道紫外检测器、Millennium32色谱工作站/电脑等组成，另外还包括打印机、断电保护器和通风柜等辅助设备。

[开机程序]

1. 状态检查：

1）检查仪器外观是否完好

2）检查各种线缆连接是否稳固，外表有无损伤痕迹

3）确认环境温度在15至35℃之间

4）相对湿度在20%至80%之间

3. 接线要求：

1）液相色谱主机电源

2）连接电脑主机和显示器电源

4. 开机步骤：

1）打开电脑电源，进入windows系统

2）打开液相色谱电源，仪器开始自检（约5～6min），待仪器操作面板上出现“Idle”字样表示自检成功，仪器进入待命状态。

[测试步骤]

1. 进入软件

1）双击电脑桌面上的Empower快捷图标，出现Empower登陆窗口。输入用户名与密码，默认账号为“system”，密码为“manager”，点击“OK”进入Empower工作站。

2）选择“运行样品”界面，点击“确定”,然后选择待选定的操作项目以及色谱系统

2 编辑仪器方法和方法组

1）在“运行样品”界面中，监视区单击方法组编辑向导。

2）选择新建按钮，弹出仪器方法编辑器。

3）通用编辑页面中，可设置单次输送体积，查看脱气选项，确认设置正确，选择等度或者梯度，总流量以及流动相配比等选项。

4）单击2475图标，弹出2475编辑界面，在波长模式中选择相应的波长模式，单波长或者双波长，输入所需的波长，选择相应的采样速率，一般为2点/秒。

5）点击“文件”，选择“另存为”，输入仪器方法名称，点击“保存”，退出。

6）在被选项中选择所需的仪器方法名称，点击“下一步”。

7）在下拉菜单中选择所需的处理方法和报告方法（如果没有合适的方法选择"无处理"、"无报告"），点击“下一步”。

8）输入方法组名称，单击"完成"。

3 运行方法进样

1）在“运行样品”界面中，选择相应的仪器方法，点击“监视器”，在监视窗口监视基线至系统平衡，停止系统监视状态，点击停止按钮。单进样，点击参数编辑快捷方式进入定义单进样参数编辑界面，输入样品名、功能、方法组等参数。点击“进样”。

2）建立样品组和样品组方法

选择“样品组”任务栏，进入样品列表，依次设置以下内容：样品瓶号、样品名称、样品类型、进样次数、进样体积、运行时间、方法组、、下一进样延迟时间等，点击“运行”，方法组开始进样。

[更换溶剂]
1.打开600E泵后，转动进口集合管阀手柄（以下简称手柄）至RUN位置；
2 .将一塑料烧杯放在参照阀出口管下以收集分流的溶剂，向右打开参照阀（断开柱和进样器）；
3. 按［Direct］键使其显示直接控制屏幕，设流速为1ml/min（梯度配比阀在0ml/min时不工作）；
4. 选择欲使用的某一溶剂通道，设其比例为*，其它为0%；
5. 将输液管从原有溶剂瓶中取出，放入一干净的空瓶中；
6. 逆时钟转动手柄至DRAW位置，用启动注射器从进口集合管阀的接口抽出约2ml溶剂；
7. 再将输液管放入新溶剂瓶内，继续抽吸直到新溶剂出来并无气泡为止；
8. 转动手柄至RUN位置，将启动注射器取下并排掉筒内的溶剂。
9. 重复5.2.2.4.~5.2.2.8.直至所有即将使用的溶剂更换完毕。

[排气泡]
1. 打开参照阀，换流动相为超纯水，设流速为10ml/min（注意：确认参照阀是打开的，否则可能损坏安装好的柱）；

2. 转动进口集合管阀手柄至DRAW位置，用启动注射器抽出约10ml水；
3. 顺时钟转动手柄至INJ位置，缓慢用力使水通过泵头从参照阀出口管排出（注意不要将气泡注入泵中）；
4. 按［Stop flow］屏幕键停泵，关上参照阀。
5. 如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下泵出口管，用塑料管连接至塑料烧杯中，设流速为10ml/min，冲洗2~5min（或更长时间）后停泵，重新接上柱。

[平衡系统（分两种情况进行）]
1. 等度模式
1.1. 每次以0.1ml/min的增量加大流速至1ml/min，以超纯水冲洗系统10min。
1.2. 检查管路连接、柱接口及泵头处是否漏液，如漏液应予以排除。
1.3. 观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应在平均值的5~10%以内。如超出此范围，可初步判断为柱前管路仍有气泡，重复5.2.3.下的步骤。
1.4. 压力波动平稳后，换检验方法规定的流动相比例冲洗系统。在检查基线稳定性前，让zui少5~6倍柱体积的流动相通过系统。
1.5. 在QuickSet窗口下的Instrument Method档内选择所需的仪器方法，按「Monitor」（此后泵由软件控制），观察基线和压力变化。如果冲洗至基线漂 移<10-3Au/min，噪声为10-4Au数量级，且压力平稳时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。5.3.1.6. 按「Abort」图标（左上第五个），停止监视基线。
2. 梯度模式
2.1. 按检验方法规定的条件冲洗平衡系统，并注意压力波动变化和排气泡。
2.2. 在进样前运行1~2次空白梯度。

[进样]
1. 在QuickSet窗口内左下部选〈Single〉标签，在Sample Name档内填写试样名称；在Function档内选择试样类型（标准选“Inject Standards”；样品选“Inject Samples”）；在Method Set档内选择所需的方法组；在Injection Volume档内输入进样体积；在Run Time档内输入记录时间。
2. 用针头滤器过滤试样溶液（注射液可不需要过滤），用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量。如按部分装液法，用微量注射器定容进样时，进样量应不大于定量环体积的50%，并要求每次进样体积准确、相同；5.4.2.2. 如按*装液法，用定量环定容进样时，进样量应不小于定量环体积的3倍（5~10倍准确性更佳）。
3. 按〈Single〉标签内右边的进样(Inject)按钮，等待窗口底部状态档内显示“Waiting”后，方可进样。
4. 将进样阀手柄转动至Load位置，将注射器针*插入进样阀入口中，平稳地注入试样溶液，除另有规定外，让注射器留在进样阀上，将进样阀手柄快速转动至Inject位置，系统将自动运行，采集数据并记录图谱。
5. 让进样阀手柄保持在Inject位置，到下次进样前1~2min切换回Load位置，将注射器从进样阀中拔出。
6. 先用水再用试样溶液清洗注射器后，按以上程序继续进样，直至完成。

[数据处理（外标法）和打印]
1. 右击系统主界面下的『Browse Project』图标，选择相应的项目，按「OK」进入Project窗口，选〈Channels〉标签。

2. 建立处理方法　选择一个待积分的标准，右击后选“Review”进入Review窗口。按「Processing Method Wizard」图标（左边*个）进入New Processing Method向导窗口，按「OK」。
2.1. 划入一个感兴趣的zui窄的峰，按「Next>」；
2.2. 划入一段包含噪声的基线，按「Next>」；
2.3. 划入一段要积分的区间，按「Next>」；
2.4. 根据情况选择zui小峰面积和zui小峰高，按「Next>」、「Next>」；
2.5. 在Name档内输入各组分峰的名称，按「Next>」、「Next>」；
2.6. 在Method Name档内填写方法名称，按「Finish」。退出Review窗口。
3. 修改标准　选中所有标准，右击后选“Alter Sample”进入Alter Sample窗口。
3.1. 在Sample Type档内将Unknown改成Standard；
3.2. 按「Amount」图标（左上第六个）进入Component Editor窗口；
3.3. 按「Copy from Process Method」图标（左上第五个），选择刚建立的处理方法，按「Open」，在Value和Units档内分别输入标准所含各组分的数值和单位，完成后按「OK」回到Alter Sample窗口；
3.4. 按「Save」图标存盘，退出Alter Sample窗口。
4. 积分　先选中所有标准，再选中所有未知样品，右击后选“Process”进入Background Processing & Reporting窗口，选Use specified processing methods，在右边档内选择刚建立的处理方法，按「OK」。
5. 打印　在Project窗口下选〈Results〉标签。
5.1. 选中要打印的标准/样品，右击后选“Preview”进入Open Report Method窗口，选合适的打印方法，按「OK」进入Report Publisher (Preview)窗口，预览打印的结果。按打印(Print)图标（左上第二个）即可打印结果。
5.2. 按「Close」可进入Report Publisher窗口对报告方法进行修改，完成后按「Print」图标（右数第二个）即可打印结果。
6. 数据处理完成后，关闭所有窗口，在主界面下按「Logout」退出系统，关闭Millennium32软件，再依次关闭电脑主机、显示器、打印机。
7. 清洗系统和关机
7.1. 数据采集完毕后，关闭检测器，继续以工作流动相冲洗10min后，换水冲洗。

[关机程序]

1）关机前应用适当比例的有机相和水相冲洗柱子

2）关闭仪器电源

3）关闭电脑电源

[维护保养程序]

1）定期清洁，保障环境和仪器室内卫生条件，防尘。

2）使用完毕后用防尘布遮盖仪器如连续3个月未使用仪器，将仪器通电1个小时后再关闭，除掉仪器内部湿气。

［注意事项］

1.使用仪器前必须仔细阅读仪器使用说明书。

2.按仪器使用要求准备测试样品，不得测试不符合要求的样品。

3.小心操作，防止样品污染和腐蚀仪器。

4.有机溶剂有害健康，各溶剂瓶口应封严。

5.仪器使用后按操作程序，切断电源，清理擦拭仪器，盖上仪器罩。

6.在操作时发生故障应停止使用，并及时通知管理人员。