技术文章

本篇文章由专业生化试剂供应商上海岚兴生物为您提供。

芽孢又叫内生孢子，通常为圆形或椭圆形，是芽孢杆菌属和梭菌属生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的体眠体结构。芽孢染色可以用的染料很多,但是由于芽孢壁厚、透性低，所以着色、脱色均较困难。

芽孢染色原理

芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。一般芽孢染色时会选用弱碱性染料，如：如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色。染色时染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。常用的芽孢染色法是孔雀石绿染色法，芽孢被染上青绿色，而菌体被番红复染为红色。

芽孢染色方法

方法1

（1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。

（2）滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。

（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4-5分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7．6%）染10分钟。

（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。

（5）用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色。

（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。

注意事项

（1）选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已经破裂。

（2）加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够则芽孢难以着色。

方法2

（1）取二支洁净的小试管，分别加入0．2ml无菌水，再往一管中加入1-2接种环的蜡状芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入1-2接种环的生孢梭菌的菌苔，两管各自充分混合成浓厚的菌悬液。

（2）在菌悬液中分别加入0．2ml苯酚品溶液，充分混合后，于沸水浴中加热3-5分钟。

（3）用接种环分别取上述混合液2-3环于两片载玻片上，涂薄，风干后，将载玻片稍倾斜于烧杯上，用95%乙醇冲洗至无红色液流出。

（4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。

（5）取1—2接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然干燥后，油镜观察，在淡紫灰色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。

芽孢染色注意事项

1.为了防止细菌体和孢子体热胀冷缩过于剧烈而发生形变从而影响两者之间形状区别的观察，芽孢染色时需要进行加热。

2.芽孢出现在微生物生长曲线的衰亡期,刚菌龄较小的菌是不会产生芽孢的.而菌龄较老的细菌容易失落鞭毛,所以芽孢染色用的菌种要控制菌龄。

镜检怎样区分芽孢死活，用什么染色剂

要区别芽孢死活用一般染色剂难以做到，芽孢本来就是休眠体，你想想休眠的动物如蛇、青蛙、熊，你怎么区分他们是死是活？当然是把他们放在合适的环境下，活的就会表现出活的迹象，比如呼吸、心跳...同理，在载玻片上芽孢区域滴上几滴芽孢萌发剂，常见的有AGFK、L-丙氨酸、葡萄糖等，这个搜索到，查文献亦可，置于30°培养箱30分钟，然后镜检，能够萌发成营养体的就是有活性的芽孢，反之就是死的（但不排除萌发受体缺失突变的芽孢，自然情况下是很少出现的，一般科学研究中才会人为筛选出）。

上海岚兴生物科技为生化试剂供应商，专业生产销售生化试剂、生物试剂、细胞培养、试剂盒、实验耗材等产品。芽孢染色试剂盒利用芽胞具有高度的折光性，外膜致密，渗透性低，着色和脱色均较困难。在加热条件下进行染色时，染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料可被酒精脱色，而芽胞上的染料仍保留，经复染剂复染后，菌体和芽胞呈现出不同的颜色。

芽孢染色试剂盒使用步骤：

1、制作一适当厚度的细菌涂片，自然干燥，通过火焰加热固定。

2、滴加适量染色液 A 于涂片上，在酒精灯上加热，使染液冒蒸汽但不沸腾。必要时可续加染液以免干涸。维持 4-5 分钟。

3、待标本冷却后以 95%酒精脱色液冲洗至无红色染液脱出为止，水洗。

4、滴加染色液 B 复染约 2-3 分钟，水洗至无染液脱出为止。

5、待干后油镜观察。预期结果：菌体呈蓝色，芽孢呈红色。

注意事项：

1.供芽孢染色用的培养物应控制菌龄，要求大部分芽孢仍保留在菌体内为宜。

2.加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够则芽孢难以着色。

3.请穿实验服并戴一次性手套操作。