分子生物学新技术与新方法的临床应用

www.xmbio.com20世纪90年代起，分子生物学进入临床检测。短短的几年中，以聚合酶链反应（PCR）为核心的分子生物学技术深入到临床多个领域。在临床检验中心，我国分子生物学在遗传病诊断及产前筛查、肿瘤诊断与疗效预后判断、微生物耐药机理的研究等方面取得较突出的成绩。

  一、微流控芯片（microfluidic chip）技术

     微流控芯片技术是芯片技术与毛细管电泳联合应用的定量检测技术。它可用于核酸（DNA和RNA）、蛋白质及细胞的检测，并已产品化。进行微流控芯片检测时，应将样品、对照和指示剂系统导入预先已有复杂毛细管道刻蚀的芯片上，经过电泳技术，利用内对照系统对产物准确定量。

   微流控芯片技术在核酸检测中引入了防污染系统，有效排除了假阳性。其与微点阵芯片不同的是每个芯片可用于多个临床样品检测，每个芯片可重复使用20次。如以DNA芯片检测为例，特异性由PCR控制，可提供检测平台和菜单式服务。此类的某些芯片每孔至少可供5个不同PCR产物同时进行分析。

该项检测目前已应用于乙型肝炎病毒（HBV）基因分型、HBV基因某些变异（如1896c变异、抗拉米呋定YMDD变异等）研究、用血安全检测和严重急性呼吸综合征冠状病毒及流感病毒检测等方面。微流控芯片技术经济耐用，还可及时简便地利用菜单为临床提供信息。由于它采用多个单纯PCR组合，可排除多重PCR检测时互相干扰而影响检测效率的问题。

二、依赖核酸序列的扩增（nucleic acid sequence based amplification，NASBA）技术和“分子灯塔”（molecular beacon）技术联合应用

   NASBA技术主要为RNA直接扩增技术，而“分子灯塔”技术为RNA扩增产物的检测技术。NASBA技术在RNA模板（sense RNA）提取后，经过引物（oligo P1和primer P2）和2次连续逆转录酶反应，在同温度条件下进入线性扩增循环，产物直接为单链反义RNA（anti-sense RNA）。“分子灯塔”技术已于前几年的荧光实时定时检测技术为先导进入临床，其基本原理是核酸杂交反应。在同时标记有荧光集团（fluorophore）和淬灭集团（quencher）的“分子灯塔”探针进入靶RNA（anti-sense RNA）生成体系中，当探针与靶RNA有同源序列结合后，利用延伸时RNA聚合酶（T7 RNA polymerase）的外切酶作用，切去淬灭集团，使荧光集团释放，然后进行检测。
NASBA技术与逆转录（RT）-PCR检测RNA不同。RT-PCR在检测RNA时，必先利用逆转录酶形成cDNA，然后利用温度阶梯进行循环扩增，产物为cDNA，引物次序包含于终产物中。而NASBA技术可直接扩增RNA，是连续等温度扩增，产物为单链RNA，引物次序不包含于终产物中。“分子灯塔”技术需低温反应，检测时以至少有109目标片段为好。而NASBA技术*反应温度为41℃，扩增后产生1014扩增物，因此，两项技术结合可形成适宜搭配，达到的匹配。

   三、蛋白质芯片与表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱技术

   由蛋白质芯片（phroteinChip）和表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱仪组成的表面增强激光解吸离于化飞行时间质谱技术（SELDI），又称为蛋白质指纹图谱。蛋白质芯片制备包括：（1）生物原始样品制备。蛋白质经亲合作用结合到芯片的化学或生物位点上。（2）制备清洗的蛋白质芯片。用水洗去非特异结合的蛋白质和缓冲液中的杂质，以消除干扰。（3）加入能量吸收分子（Energy Absorb Molecule，EAM）。芯片干燥后，每个位点上加能量吸收分子，与蛋白质结合为混合晶体，以促进蛋白质在SELDI检测中的解吸附和离子化。SELDI测定包括：（1）用激光解吸电离的方法将保留在芯片上的蛋白质解离出来。（2）电离的蛋白质可通过表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱地测定出它们的质量。

    SELDI技术可观察到一组蛋白质的动态变化，可检测到经典方法无法测定的低丰度的蛋白质。蛋白质芯片技术是近几年生命科学领域中已崭露头角的新技术，它正在与各项生物技术有机结合中，扩展其应用范围。目前蛋白质芯片与SELDI技术已广泛应用于癌症、老年病、感染性疾病、心血管病等多种疾病研究，且成功地发现了艾滋病的抑制蛋白。美国FDA和NIH建立了早期检测和卵巢癌的血清蛋白质指纹图谱。在脑脊液中定量检测β淀粉样变蛋白用于早期诊断老年痴呆也取得一定进展，并为设计特异性靶向蛋白抑制剂治疗药物提供了可靠依据。我国学者也报告了该技术在结直肠癌筛选的结果。虽然，SELDI技术创建至今仅4年，临床应用报告仅见于近2年，但其在诊断学应用上已显示出光明的前景，将给临床诊断学带来新的希望。

    总而言之，医学技术的发展及其临床应用的广泛开展，必定为未来新的诊疗方法提供可能性，这些技术也只有在应用过程中才能得到恰当的评估和改进。检验界的同行们积极关心新技术的出现和参与应用与改进，定将能拓展出更多的项目应用于临床检验工作中。