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细胞生物活性的化学检测法

武汉贝茵莱生物科技有限公司

2010/12/10 15:08:24

 

一、四唑盐(MTT)比色法:

 

检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外,还可用四唑盐比色法试验(MTT)。此法的原理是:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物,并沉积在细胞中,而细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物,用酶联免疫检测,以在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。

 

●0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞,用含0.1%胎牛血清的RPMI培养基配成1 x10^9个/L的但细胞悬液,将细胞接种于96孔培养板中,每孔100ul。

 

●将培养板置CO2培养箱中,在37℃、5%CO2条件下,培养3-5天。

 

●培养3-5天后,每孔加入MTT溶液10ul,继续置培养箱孵育3-6h,终止培养,加10%SDS-HCl 100ul/孔,37℃培养数小时,将细胞内与细胞周围的MTT颗粒充分溶解。

 

●用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度(OD),选波长490nm。以时间为横轴,OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。

 

用此法测细胞活力,为保证结果的准确性,在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,再确定每孔细胞接种数和培养时间,以保证培养终止时不会过满。另外,实验时设空白对照,比色时,以空白孔调零。

 

二、细胞蛋白质含量测定法(考马斯亮蓝测定法):

 

基本原理为:考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合,在595nm波长处呈zui大吸收,其OD值与蛋白质含量成正比。主要用于测定妹、受体及细胞外代谢物的特异性活性。

 

●用0.25%胰蛋白酶消化细胞,制成悬液,用含10%胎牛血清的RPMI培养基调整细胞浓度为1×104个/ml,接种24孔培养板,每孔1ml,置37℃、5%CO2条件下培养一段时间。

 

●用胰蛋白酶消化分散,培养板的细胞悬浮在PBS中,细胞计数,取106细胞以1000r/min离心5min,弃上清,加0.5 ml 0.1%SDS或0.3mol/LNaOH,置100℃煮3min,使细胞裂解。

 

●取0.1考马斯亮蓝染液与100ul上述细胞裂解液混匀,放置10min。

 

●用可见光分光光度计在595nm波长处测定溶液的OD值。以溶剂为空白对照,以已知量的牛血清蛋白为标准品,绘制标准曲线。然后根据曲线推算样品中蛋白质含量。

 

三、细胞蛋白质合成测定法(3H-亮氨酸掺入法):

 

基本原理为:细胞在合成蛋白质时需要摄取外源性氨基酸,用同位素标记氨基酸如3H-亮氨酸可以掺入细胞蛋白合成代谢中,通过测定细胞的放射性强度,可了解细胞蛋白质合成代谢情况。

 

●取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,悬浮于含10%胎牛血清的RPMI培养基中,调整细胞密度107-109个/L,接种于24孔培养板,每孔1ml。

 

●将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞处于对数生长期时,每孔100ul预温37℃的3H-亮氨酸。

 

●继续培养4-24h。

 

●终止培养,取出培养板,小心吸取培养上清,用预冷的PBS洗涤,晾干。如果细胞松散,可先用甲醇固定10min。

 

●把培养板放在冰盖上,每孔加1ml 10%三氯醋酸(TCA),在4℃放置10min,吸取上清。

 

●甲醇洗涤、晾干。

 

●每孔加0.5ml 10.3 mol/L NaOH,1%SDS,室温下放置30min。

 

●混匀,移入闪烁液,用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数(cpm),以cpm/106细胞或cpm/mg蛋白表示。

 
对悬浮生长的细胞则采用离心法处理。

 

四、细胞DNA合成测定法:

 

1、3H-TdR掺入法

 

基本原理为:胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA*的碱基,也是DNA合成的必需物质。用同位素3H标记即3H-TdR作为DNA合成的前体掺入DNA合成代谢过程中,通过测定细胞的放射性强度,可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。

 

(一)方法一

 

●取对数生长期细胞,制成3 X 10^8个/L的细胞悬液,接种于24孔培养板中,每孔1ml。

 

●将培养板放入37℃、5%CO2培养箱中培养24h左右。

 

●在细胞处于对数生长期时,每孔加入100ul3H-TdR(用HBSS)配制,3.7 X 10^8 Bp/L过滤除菌,使终浓度为3.7 X 10^7 Bp/L。

 

●继续培养1-24h。

 

●终止培养,小心吸弃上清,用HBSS漂洗单层细胞2次,然后加入2mo预冷的10%TCA,放置10min。如果细胞松散,应先用固定甲醇10min,用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数,结果以cpm/10^6细胞表示。

 

(二)方法二

 

●同方法一*步。

 

●将培养板放入37℃、5%CO2培养箱中培养56h左右。

 

●每孔加入100ul 3H-TdR。

 

●继续培养16h。

 

●终止培养,将细胞收集于49型滤膜上,如为贴壁细胞,吸弃培养上清后,用0.25%胰蛋白酶消化2-5min;如为血细胞,先用蒸馏水破红细胞。然后再收集细胞,收集后要加10%CTA和甲醇固定。

 

●将滤膜烘干后移入已知有3min闪烁液的闪烁瓶中,在液体闪烁计数仪上测定每分钟脉冲数或衰变数,结果以cpm/10^6细胞或dpm/10^6细胞表示。

 

2、流式细胞仪测定DNA合成

 

用流式细胞仪测定细胞增殖周期和DNA合成是20世纪90年代发展起来的新手段,不仅快速、准确、效果好,而且消除了同位素标记的许多繁琐方法和放射性污染。

 

●取80%汇合至接近*汇合的细胞,用0.25%胰蛋白酶消化细胞,制备成单细胞悬液,细胞密度1想0^9个/L,注意不要留有细胞碎片。

 

进行流式细胞仪检测。除检测细胞周期时相变化和反应DNA合成外,还可了解染色体倍性;结合荧光免疫法,还可对细胞膜进行分析等。

 

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