细胞生物活性的化学检测法

一、四唑盐（MTT）比色法：

检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外，还可用四唑盐比色法试验（MTT）。此法的原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测，以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。

●0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培养基配成1 x10^9个/L的但细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100ul。

●将培养板置CO2培养箱中，在37℃、5%CO2条件下，培养3-5天。

●培养3-5天后，每孔加入MTT溶液10ul，继续置培养箱孵育3-6h，终止培养，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培养数小时，将细胞内与细胞周围的MTT颗粒充分溶解。

●用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度（OD），选波长490nm。以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。

用此法测细胞活力，为保证结果的准确性，在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，再确定每孔细胞接种数和培养时间，以保证培养终止时不会过满。另外，实验时设空白对照，比色时，以空白孔调零。

二、细胞蛋白质含量测定法（考马斯亮蓝测定法）：

基本原理为：考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合，在595nm波长处呈zui大吸收，其OD值与蛋白质含量成正比。主要用于测定妹、受体及细胞外代谢物的特异性活性。

●用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成悬液，用含10%胎牛血清的RPMI培养基调整细胞浓度为1×10⁴个/ml，接种24孔培养板，每孔1ml，置37℃、5%CO₂条件下培养一段时间。

●用胰蛋白酶消化分散，培养板的细胞悬浮在PBS中，细胞计数，取10⁶细胞以1000r/min离心5min，弃上清，加0.5 ml 0.1%SDS或0.3mol/LNaOH，置100℃煮3min，使细胞裂解。

●取0.1考马斯亮蓝染液与100ul上述细胞裂解液混匀，放置10min。

●用可见光分光光度计在595nm波长处测定溶液的OD值。以溶剂为空白对照，以已知量的牛血清蛋白为标准品，绘制标准曲线。然后根据曲线推算样品中蛋白质含量。

三、细胞蛋白质合成测定法（³H-亮氨酸掺入法）：

基本原理为：细胞在合成蛋白质时需要摄取外源性氨基酸，用同位素标记氨基酸如³H-亮氨酸可以掺入细胞蛋白合成代谢中，通过测定细胞的放射性强度，可了解细胞蛋白质合成代谢情况。

●取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，悬浮于含10%胎牛血清的RPMI培养基中，调整细胞密度10⁷-10⁹个/L，接种于24孔培养板，每孔1ml。

●将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞处于对数生长期时，每孔100ul预温37℃的³H-亮氨酸。

●继续培养4-24h。

●终止培养，取出培养板，小心吸取培养上清，用预冷的PBS洗涤，晾干。如果细胞松散，可先用甲醇固定10min。

●把培养板放在冰盖上，每孔加1ml 10%三氯醋酸（TCA），在4℃放置10min，吸取上清。

●甲醇洗涤、晾干。

●每孔加0.5ml 10.3 mol/L NaOH，1%SDS，室温下放置30min。

●混匀，移入闪烁液，用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数（cpm），以cpm/10⁶细胞或cpm/mg蛋白表示。

四、细胞DNA合成测定法：

1、³H-TdR掺入法

基本原理为：胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA*的碱基，也是DNA合成的必需物质。用同位素³H标记即³H-TdR作为DNA合成的前体掺入DNA合成代谢过程中，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。

（一）方法一

●取对数生长期细胞，制成3 X 10^8个/L的细胞悬液，接种于24孔培养板中，每孔1ml。

●将培养板放入37℃、5%CO2培养箱中培养24h左右。

●在细胞处于对数生长期时，每孔加入100ul³H-TdR（用HBSS）配制，3.7 X 10^8 Bp/L过滤除菌，使终浓度为3.7 X 10^7 Bp/L。

●继续培养1-24h。

●终止培养，小心吸弃上清，用HBSS漂洗单层细胞2次，然后加入2mo预冷的10%TCA，放置10min。如果细胞松散，应先用固定甲醇10min，用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数，结果以cpm/10^6细胞表示。

（二）方法二

●同方法一*步。

●将培养板放入37℃、5%CO2培养箱中培养56h左右。

●每孔加入100ul ³H-TdR。

●继续培养16h。

●终止培养，将细胞收集于49型滤膜上，如为贴壁细胞，吸弃培养上清后，用0.25%胰蛋白酶消化2-5min；如为血细胞，先用蒸馏水破红细胞。然后再收集细胞，收集后要加10%CTA和甲醇固定。

●将滤膜烘干后移入已知有3min闪烁液的闪烁瓶中，在液体闪烁计数仪上测定每分钟脉冲数或衰变数，结果以cpm/10^6细胞或dpm/10^6细胞表示。

2、流式细胞仪测定DNA合成

用流式细胞仪测定细胞增殖周期和DNA合成是20世纪90年代发展起来的新手段，不仅快速、准确、效果好，而且消除了同位素标记的许多繁琐方法和放射性污染。

●取80%汇合至接近*汇合的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制备成单细胞悬液，细胞密度1想0^9个/L，注意不要留有细胞碎片。

进行流式细胞仪检测。除检测细胞周期时相变化和反应DNA合成外，还可了解染色体倍性；结合荧光免疫法，还可对细胞膜进行分析等。