实验室新手指南之植物组织培养

MS 培养液的配置

MS 大量元素母液的配制

一般将大量元素配制成 10 倍的母液，使用时再稀释 10 倍。按照配方表中用量依次分别称取扩大 10 倍的：NH4NO₃、 KNO₃ ,KH₂PO4、MgSO4.7H₂O、CaCl2.2H₂O 的量，所有药品称取完毕后用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，zui后定容至 1000ml，转入 1000ml 细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于 4℃冰箱中保存备用。

MS 微量元素母液的配制

一般将微量元素配制成 100 倍的母液，使用时再稀释 100倍。

按照配方表中用量分别依次称取：MnSO4 ?4H2O、ZnSO4?7H2O 、

H2BO3 、NaMoO4?2H2O、 CuSO4?5H2O、 C℃l2?6H2O 扩大 100 倍的量，用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至

1000ml，转入 1000ml 细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于 4℃冰箱中保存备用。

MS 铁盐母液配制

一般将铁盐配制成 100 倍的母液，使用时再稀释 100 倍。按照配方表中用量分别称取扩大 100 倍的：FeSO₄—7H₂O 和 Na₂— EDTA—2H₂O 的量，把 FeSO₄—7H₂O 和 Na₂—EDTA—2H₂O 分别置于 200ml 蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解(磁力搅拌器，边加热，边搅拌)。保持加热，把 FeSO₄ 溶液慢慢倒入 Na₂—EDTA 溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后加蒸馏水到zui终容积 1000ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡 1～2min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于 4℃冰箱中保存备用。

MS 有机化合物母液的配制

一般将有机化合物配制成 100 倍的母液，使用时再稀释 100 倍。按照配方表中用量分别称取扩大 100 倍的：肌醇、维生素 B1、烟酸、甘氨酸、维生素 B6 的量，用蒸馏水依次溶解并定容至 500ml 后，转入 500ml 细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于 4℃冰箱中保存备用。

植物激素的配制

常见激素：二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸 (IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、激动素(6-糠氨基嘌呤、 KT)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、赤霉素(GA3)。

生长素类：

1. 生长素类在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织
2. 常见生长素：二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)。NAA、IAA、IBA 被广泛用于生根，2，4-D 有利于愈伤组织的诱导和生长。IAA 容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存时间不要太久。
3. 溶解方法：用少量 1mol/L NaOH 或 95%酒精预溶解，再加蒸馏水定容，以前者为好。
4. 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存

细胞分裂素

组织培养中，细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。

1. 常用的细胞分裂素有： 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、激动素(6-糠氨

基嘌呤、 KT)、玉米素(ZT)、噻二唑苯基脲( thidiazuron、 TDZ )。

1. 溶解方法：用少量(1ml)1mol/L HCL 预溶解，再加蒸馏水定容。
2. 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存。

赤霉素(GA3)

1. 溶解方法：用少量 95%酒精预溶解，再加蒸馏水定容。
2. 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存。
3. 赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解。
4. 灭菌：高温易分解，要过滤灭菌。

脱落酸

1. 溶解：易溶于 NaHCO3 溶液、氯fang或丙酮。
2. 保存：具有热稳定性，但容易发生光解。配成一定浓度后，冰箱冷藏保存。

培养基的制备与灭菌

培养基的制备

1. 将所需的各种母液和植物激素按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在位置。
2. 取烧杯一个内盛 200ml 蒸馏水，按照培养基配方所需量依次取母液和植物激素加入烧杯，搅拌，按相应培养基称量蔗糖和琼脂，并添加到烧杯中，在电炉上加热待琼脂*融化后加蒸馏水定容至所需体积。
3. 充分混合后，用 1mol/LNaOH 和 1mol/LHCl 调节培养基的 pH 为培养基要求 pH 值。
4. 趁热把培养基分装到广口瓶中。封好瓶口。待灭菌。

培养基的灭菌

灭菌温度及灭菌时间：121℃(1.06kg/cm2)下灭菌 20 分钟。(如是实验所用菌材灭菌，如无菌水及器械，则是 121℃(1.06kg/cm2) 下灭菌 30 分钟)

1. 检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。
2. 盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。
3. 灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到 0 时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。
4. 刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷却。在室温下放置 1-2 天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否*灭菌。经检查没有杂菌生长的方可使用。

无菌操作技术和接种

1. 接种前，用 75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种房间紫外灯，照射约 30min，然后关闭紫外灯。打开房间换气扇及微开超净工作台的玻璃挡板，通风 20min 后，即可进行无菌操作。(此步由专人统一负责)
2. 接种室灭菌过程中同时对外植体进行表面灭菌。先将接种材料在流动的自来水下涮洗干净，吸干水份后切成大约 70mm 长的片段放进 500ml 烧杯中，用蒸馏水冲洗 2 次，倒掉蒸馏水后倒入 0.1%的升gong水消毒，将材料淹没浸泡约 10 分钟(期间用镊子搅拌几次)。
3. 把在消毒液中的接种材料转移到超净工作台上。用无菌镊子将已完成灭菌的接种材料转移到烧杯中，用无菌水清洗3次，每次不少于 1 分钟，洗时不断摇动烧杯以确保*除去消毒液。zui后一次清洗后转移到无菌托碟上，将接种材料切成一定大小(花托 0.5cm2、茎段 0.5-1cm)。
4. 取下培养瓶的盖子用火烧灼瓶口。用镊子将外植体轻轻插入到琼脂上，立即盖上盖子。
5. 操作完后将镊子等器械浸入 75%酒精中。操作器械需要在每次使用前消毒一次。方法是将浸于酒精中的器械取出后置于酒精灯火焰上充分灼烧，待冷却后方可使用。
6. 将培养瓶放到培养箱里，在要求温度下培养，观察记录。