尽管ELISA法操作简单，但可能影响测定结果的因素也较多。故在实际操作的过程中，要加强质量管理，认真避免或减少影响因素，力求结果准确，为疾病的诊断和科研提供可靠的依据。为确保试验的成功，进口elisa试剂盒操作中要留意以下问题：
加样：孵育前加样时间过长，酶试剂加出孔外，使用滴瓶滴加试剂时，滴加的角度不同和挤压的力度不同，致使滴加的试剂量不准，都可导致试验结果不准确。控制方法：①实验样本过多时，可分批次操作，以减少实验时间延长造成的误差；②加酶试剂后，用吸水纸吸干孔外试剂；③作定量试验时，使用加样器加注试剂，并经常校正其准确性，此外，要做到一份样本一个移液头，防止交叉污染。
温育：温育是ELISA测定为关键、容易出现问题的步骤。为常见的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2-8℃。目前国内售ELISA试剂盒温育时间为37℃，30 min-1 h，进口elisa试剂盒则通常为37℃，1-2 h能有较*的结合。
温育时间、温度的选择一般根据试剂盒的说明书选择温育的时间、温度。加完样本和（或）试剂后将微孔板从室温放入水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃需要一定时间，如果是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就容易造成实际测定中温育时间不够，易致弱阳性标本测不出来。控制方法：①如有两种温度，尽量使用较低的温育温度、较长反应时间的条件；②用1个小温度计放置在板孔反应液中测量观察。
“边缘效应”的排除“边缘效应”是在使用96孔板的ELISA测定中，外周孔显色较中心孔深的现象。产生的原因可能是为96孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的，因此在温育时尽量采用水浴。
洗板：ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。采用手工洗板，孔与孔之间液体易交叉，采用半自动洗板机时，洗液量不足导致洗板不*，洗板针堵塞导致抽吸不*，洗板不畅导致清洗效果差。控制方法：①手工洗板时，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离；②洗板机洗板时应经常检查冲洗头是否通畅，若被杂物堵塞时可用注射器针头挑出；③为了洗涤效果好，实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法，在机器洗涤后再进行人工洗板1-2次，或适当增加洗板的次数，有资料报道洗板7次能达到理想的洗涤效果。
显色：市售ELISA试剂盒中，如以四甲基联苯胺(TMB)为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以邻苯二胺(OPD)为底物，则试剂盒提供邻苯二胺片剂或粉剂。显色反应条件为37℃或室温反应15-30 min。以邻苯二胺(OPD)为底物的试剂，要临用前30 min配制且必须避光。以四甲基联苯胺(TMB)为底物的试剂则不需避光，但A、B液应尽量避免接触金属器械。
结果判定：读取结果要在15-30 min内完成，定性测定用肉眼判读试验结果时，反应板应水平距离白色背景10-15 cm；定量测定时用酶标仪读取结果，酶标仪不应置于阳光或强光照射下，需先预热15-30 min再进行测试。
