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丙酮酸脱羧酶（PDC）活性检测试剂盒

商品货号：MS1006
英文名称：Micro Pyruvate Decarboxylase (PDC) Assay Kit
别名：丙酮酸脱羧酶试剂盒 PDC Kit 丙酮酸脱羧酶（PDC）试剂盒 丙酮酸脱羧酶（PDC）测试盒
检测方法：微量法

测定意义：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

测定原理：

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+；NADH在340nm有吸收峰，而NAD+没有；通过测定340nm光吸收下降速率，来计算PDC活性。

货号：MS1006                                                    规格：100管/96样

丙酮酸脱羧酶（PDC）活性测定试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

测定原理：

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD⁺；NADH在340nm有吸收峰，而NAD⁺没有；通过测定340nm光吸收下降速率，来计算PDC活性。

自备实验用品及仪器：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体×1 瓶，﹣20℃保存。

混合试剂：临用前配制，小心把试剂四转移到试剂三中，充分溶解。

试剂六：液体×1 管，4℃保存。

粗酶液提取：

1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，工作3s，间歇10s，工作35次），16000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

2、组织处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，16000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

PDC 测定操作：

1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。

2.试剂二置于25℃水浴中预热30min。

3.空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水、20μL混合试剂、140μL试剂二和20μL试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A1和A2。

4.测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合试剂、140μL试剂二和20μL试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A3和A4。

注意：空白管只需测定一次。

PDC 活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化1μmolNADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (μmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10⁶}÷(Cpr×V样)÷T

=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中，每克组织每分钟催化 1μmol NADH 氧化为 1 个酶活单位。

PDC(μmol/min/g) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10⁶}÷(W×V样÷V样总) ÷T

=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中，每10⁴个细胞每分钟催化1μmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (μmol/min/10⁴cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10⁶}÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷细胞数量

（4）按血清（浆）体积计算

活性单位定义：25℃中，每毫升血清（浆）每分钟催化1μmol NADH氧化为1个酶活单位。

PDC (μmol/min/mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10⁶}÷V 样÷÷T

=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4 L，V 样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量试剂盒；W ：样品质量； T：反应时间，1 min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADH氧化为1个酶活单位。

PDC (μmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10⁶}÷(Cpr×V 样) ÷T=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中，每克组织每分钟催化 1μmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (μmol/min/g) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10⁶}÷(W×V 样÷V 样总) ÷T=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中，每10⁴个细胞每分钟催化1μmol NADH氧化为1个酶活单位。

PDC (μmol/min/10⁴cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10⁶}÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷细胞数量

（4）按血清（浆）体积计算

活性单位定义：25℃中，每毫升血清（浆）每分钟催化1μmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (μmol/min/mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10⁶}÷V 样÷÷T

=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V 总：反应体系总体积，0.2mL=2×10 ^-4 L，V 样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒；W ：样品质量； T：反应时间，1min。

注意事项：配制好的混合液3天内使用完。